2001年Hoffman等^[1]报道家族性荨麻疹和Muckle-Wells综合征由NALP3（NACHT-LRR-PYD结构域蛋白3）基因突变引起，之后NALP3炎性体的相关研究开始集中于自身免疫性疾病和慢性炎症，NALP3通过识别和控制微生物感染，促进宿主对外界的防御作用，在固有免疫中发挥重要作用^[2]。NALP3炎性体是一种分子复合体，由支架蛋白NALP3、凋亡相关斑点样蛋白和胱天蛋白酶1（caspase-1，CP-1）组成^[3]。在病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）刺激下，NALP3招募CP-1前体，并寡聚体化使其实现空间距离接近，通过自身切割形成成熟的CP-1，以炎性体复合物中心效应蛋白的形式作用于白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）前体，使其成熟并分泌至细胞外，促进炎症发生及发展^[4]。

牙周炎是以特异性龈下菌斑刺激引起宿主免疫应答为特征的慢性炎症性疾病。革兰阴性菌细胞壁脂多糖能刺激免疫细胞分泌炎症细胞因子，引发牙周炎^[5]。免疫细胞分泌炎症因子受宿主免疫系统调节，当宿主免疫应答失衡时炎症因子分泌过量或减少，导致牙周炎症的进展。近年研究表明，NALP3炎性体作为一种模式识别受体存在于免疫细胞中，能识别胞外炎症性刺激并介导机体相应免疫应答^[6]。Pétrilli等^[7]发现NALP3炎性体和IL-1β在牙周炎患者牙龈上皮中的表达明显升高，且两者呈显著正相关，表明NALP3炎性体与牙周炎相关联，但其如何在牙周炎免疫细胞中调节炎症因子的分泌尚不清楚。本研究以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）脂多糖刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为体外模型，采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、蛋白质印迹法和酶联免疫吸附测定等方法，验证Pg脂多糖是否激活RAW264.7细胞中NALP3炎性体，诱导IL-1β产生和分泌。同时，运用CP-1特异性抑制剂AC-YVAD-CMK阻断NALP3炎性体信号通路，探讨炎性因子IL-1β的分泌变化。通过上述研究，证实NALP3炎性体对牙周炎巨噬细胞炎症因子分泌的调节作用，以期进一步为牙周炎的预防和治疗提供新思路和方法。

本项研究时间为2012年9月至2016年3月。

小鼠巨噬细胞系RAW264.7由武汉大学口腔医学院中心实验室提供。0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司、胎牛血清购自美国Gibco公司；达尔伯克改良伊格尔培养液（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）高糖培养基购自美国Hyclone公司；Pg脂多糖购自美国Invivogen公司；总RNA提取试剂（RNA Lyzol）购自美国Omega公司；反转录试剂盒（RT reagent Kit）购自美国Fermentas公司；qPCR试剂购自瑞士Roche公司；NALP3单克隆抗体购自美国CST公司；CP-1抑制剂AC-YVAD-CMK购自瑞士BFB公司，它溶解于二甲基亚砜作为储存液使用。细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本Dojindo公司；IL-1β的酶联免疫吸附测定试剂盒（E-EL-M0037）购自中国Elabscience公司。

RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5% CO₂浓度及饱和湿度恒温箱中培养，每2天换液1次。本实验细胞分为3组：A组为对照组（细胞未处理）；B组为1 mg/L Pg脂多糖刺激组；C组为CP-1抑制剂AC-YVAD-CMK预处理+1 mg/L Pg脂多糖刺激组。C组Pg脂多糖刺激前对细胞用100 μmol/L AC-YVAD-CMK预处理2 h。

将细胞以1×10⁴个/孔的密度接种至96孔板，并在含10%血清DMEM培养基中培养过夜，之后细胞在连续稀释（5、10、25、50、75、100、200 ?mol/L）AC-YVAD-CMK和1 mg/L Pg脂多糖作用下孵育24 h。参照CCK-8试剂盒说明测定细胞活力，用酶标仪测量450 nm处吸光度值（A₄₅₀值）。细胞活力用吸光度值比值表示，细胞活力计算方法：生存率=（实验组平均吸光度值÷对照组平均吸光度值）×100%。实验重复3次。

为确保RNA产量，将RAW264.7细胞以4×10⁴个/cm²的密度接种于6孔板中并培养24 h。然后将细胞分为3组，处理方式同上。6 h后RAW264.7细胞RNA采用Omega试剂盒提取，其浓度和纯度通过NanoDrop 2000对260、230、280 nm处吸光度值进行测定。cDNA由反转录试剂盒得到，根据产品说明书加入相应SYBR Green Master Mix（Roche，Switzerland），用Bio-Rad热循环仪进行PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸34 s，2~4步骤40个循环。所测基因用如下特异性引物扩增，qPCR引物序列见表1。

用蛋白质印迹法测定NALP3蛋白水平。RAW264.7细胞以4×10⁴个/cm²的密度接种于6孔板中并培养24 h，然后将细胞分为3组，处理方式如上所述。24 h后收集细胞并裂解蛋白。样品分别以50 ?g每孔浓度在8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳然后转移至聚偏氟乙烯膜。膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，之后在NALP3单克隆抗体中4 ℃孵育过夜。第2天含有吐温20的Tris-HCl盐缓冲液（Tris buffered saline with Tween 20，TBST）洗涤3次，每次10 min，然后在辣根过氧化物酶标记二抗下室温孵育1 h。膜用TBST再次漂洗3次之后用增强型化学发光系统（ECL Thermo）孵育5 min并曝光于X线片上。

细胞培养和处理方法同蛋白质印迹法，收集细胞培养上清液，其中IL-1β浓度采用酶联免疫吸附测定试剂盒并根据说明书步骤进行分析。样品和标准液加入由IL-1β单克隆抗体预涂层的酶联免疫吸附试验孔内，37 ℃孵育90 min后，多克隆IL-1β抗体加入溶液中并37 ℃孵育1 h，辣根过氧化物酶二抗加入溶液中并孵育30 min，加入基质液并在37 ℃反应15 min后终止，在酶标仪上读取A₄₅₀值。IL-1β和NALP3的mRNA水平通过qPCR以内参GAPDH作为参照进行分析，其值为2^-ΔΔCt，所有值均取自3次独立重复实验的均值±标准差。

本实验结果均由每个处理组3个独立重复实验得出。实验数据通过SPSS 17.0统计软件处理，细胞活力试验结果采用单因素方差分析，qPCR、蛋白质免疫印迹法和酶联免疫吸附测定结果采用独立样本t检验进行统计学分析，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

0、5、10、25、50、75、100及200 ?mol/L AC-YVAD-CMK处理RAW264.7细胞，其A₄₅₀值分别为0.399±0.009、0.398±0.012、0.396±0.023、0.394±0.014、0.398±0.010、0.392±0.017、0.395±0.008及0.391±0.027，不同浓度AC-YVAD-CMK对细胞活力无明显影响，不同浓度药物组与对照组（0 μmol/L）相比差异无统计学意义（P>0.05）。

见表2。qPCR检测了Pg脂多糖刺激组以及AC-YVAD-CMK处理组RAW264.7细胞中IL-1β和NALP3基因转录水平。IL-1β和NALP3在B组较A组表达水平显著升高（P<0.01，P<0.01），在C组较B组表达水平显著降低（P=0.002，P=0.027）。以上结果表明Pg脂多糖激活RAW264.7细胞中NALP3和IL-1β基因转录，采用AC-YVAD-CMK抑制Pg脂多糖诱导的NALP3和IL-1β基因转录。

见图1。蛋白质印迹法结果显示，RAW264.7细胞在A组少量表达NALP3蛋白，B组较A组NALP3蛋白和IL-1β表达均显著增加（P<0.01），C组较B组二者的表达水平均显著降低（P<0.01），3组值分别1.00±0.10、2.34±0.04、1.64±0.04，差异有统计学意义。酶联免疫吸附测定结果显示，A、B、C组IL-1β分泌值分别为（40.20±0.25）、（61.50±1.81）、（52.40±1.91）ng/L，A组分泌少量炎性细胞因子IL-1β，B组较A组分泌量显著增加（P<0.01），C组较B组分泌水平显著降低（P<0.01）。以上结果表明，Pg脂多糖激活RAW264.7细胞中NALP3蛋白合成和IL-1β分泌，采用AC-YVAD-CMK可以抑制Pg脂多糖诱导的NALP3蛋白合成和IL-1β分泌。

A组：对照组（细胞未处理）；B组：1 mg/L Pg脂多糖刺激组；C组：胱天蛋白酶1抑制剂AC-YVAD-CMK预处理+1 mg/L Pg脂多糖刺激组；Pg：牙龈卟啉单胞菌

牙周炎的发生始于牙周致病菌，其在牙周袋中定植并聚集形成龈下菌斑，产生毒力因子如脂多糖等刺激龈沟底及牙龈上皮内免疫细胞分泌炎性因子，介导炎症反应引起牙周组织破坏，外来病原菌与机体免疫应答共同作用，导致炎症进展。巨噬细胞是牙周炎发生过程中重要的免疫细胞，可以被牙周致病菌及其产物激活从血液中迁移至感染区域，吞噬牙周致病菌同时分泌蛋白酶及炎性细胞因子破坏牙周结缔组织和促进骨吸收，在宿主抵御牙周病原菌感染过程中发挥重要作用^[8]。体外研究显示，NALP3炎性体存在于巨噬细胞中并能感知外界病原刺激，参与固有免疫反应，调节炎症应答^[9]。在痛风性关节炎中，NALP3炎性体在尿酸盐结晶刺激下激活并介导IL-1β等炎症因子的分泌引起关节急性炎症^[10]。随着时间延长，间歇性的急性损伤逐渐发展为慢性痛风性关节病并导致骨和关节软骨的破坏。在牙周炎中，Pétrilli等^[7]研究已经证实NALP3炎性体在牙龈上皮中表达升高，但是其在牙周炎症中的激活及调节过程尚不清楚。本实验以巨噬细胞作为研究对象，采用Pg脂多糖刺激，探讨巨噬细胞NALP3炎性体在牙周炎中的激活情况。结果显示，巨噬细胞中NALP3炎性复合体在牙周炎致病菌内毒素作用下能够被激活，表明牙周炎中巨噬细胞能激活NALP3炎性体调控机体免疫应答反应，这与Guo等^[11]采用Pg提取内毒素诱导上皮细胞NALP3表达的结果一致。

NALP3炎性体是Nod样受体（nod-like receptor，NLR）家族的重要成员之一，在静息状态下以非活性形式存在于胞质中，激活后NALP3发生空间构象变化并活化IL-1β转化酶CP-1作用于IL-1β前体，使其在第116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间断开，从相对分子质量为35 000的前体形式转化为相对分子质量17 000的成熟形式并分泌至细胞外^[4]。NALP3炎性体通过上述一系列级联反应促使IL-1β形成活性形式并发挥功能效应。临床研究显示，IL-1β在牙周炎患者牙龈组织和龈沟液中表达升高，可介导牙周组织中炎症细胞因子基质金属蛋白酶等释放和促进骨吸收，在牙周炎中扮演重要角色^[12,13]。同时Halle等^[14]研究中，敲除NALP3基因的小鼠巨噬细胞无法在β-淀粉样蛋白刺激下释放IL-1β，表明β-淀粉样蛋白通过激活NALP3炎性体进而促进IL-1β分泌。在牙周炎中，改变巨噬细胞中NALP3炎性体是否引起IL-1β分泌变化尚未可知。本实验运用Pg脂多糖刺激，结果显示NALP3的mRNA表达量是原来的1~2倍，而IL-1β表达量增加至6~7倍，这与丁子清等^[15]在炎性牙周组织中检测到NALP3和IL-1β的mRNA水平升高结果一致。同时，NALP3蛋白表达和IL-1β蛋白分泌水平均升高，表明牙周炎中NALP3炎性体激活并促进IL-1β合成分泌，导致炎症级联反应发生，从而造成牙周组织持续破坏。反之，在Pg脂多糖刺激前运用CP-1抑制剂AC-YVAD-CMK作用，发现NALP3炎性体和IL-1β的mRNA和蛋白表达均减少。此现象说明阻断NALP3炎性体可以抑制Pg脂多糖引起的IL-1β分泌，进一步证实牙周炎中激活NALP3炎性体信号通路可引起IL-1β释放，提示可以通过阻断NALP3炎性体信号通路，抑制炎症因子分泌引起的组织破坏。

综上所述，NALP3炎性体在牙周炎症状态下对巨噬细胞炎症因子分泌具有调节作用，参与机体免疫反应，阻断该通路能够引起炎症因子释放减少。然而，NALP3炎性体如何识别Pg脂多糖及NALP3炎性体各组成部分在其中的表达及作用等尚待深入探讨，NALP3炎性体在牙周炎症微环境中的激活和调节机制也有待进一步研究。