自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征患者外周血CDCD T细胞的临床意义

目的

了解自身免疫性溶血性贫血（AIHA）/Evans综合征（ES）患者外周血CD₄⁺CD₆₉⁺T细胞的临床意义。

方法

选取2015年10月至2016年5月于天津医科大学总医院血液科住院的AIHA/ES患者32例，其中溶血发作组15例，缓解组17例；健康对照13名。以流式细胞仪检测外周血CD₆₉⁺T细胞；实时定量PCR检测外周血CD₄⁺T细胞中CD₆₉ mRNA表达水平；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆CD₆₉浓度。

结果

（1）溶血发作组的CD₃⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺ T细胞比例高于缓解组[(3.08±1.48)%比（1.96±1.33)%, P<0.05]和健康对照组[(1.28±0.83)%, P<0.01]；溶血发作组CD₃⁺CD₆₉⁺T细胞绝对值高于健康对照组[(2.94±1.81)×10⁷/L比（1.48±1.42)×10⁷/L, P<0.05]。（2）溶血发作组CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例高于缓解组[(2.16±1.56)%比（1.16±0.62)%，P<0.05]及健康对照组[(0.94±0.78)%，P<0.05]；溶血发作组CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺T细胞绝对值高于健康对照组[(1.04±0.98)×10⁷/L比（0.44±0.38)×10⁷/L，P<0.05]。（3）溶血发作组CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₈⁺ T细胞比例高于健康对照组[(4.87±2.56)%比（1.83±1.27)%，P<0.01]；但CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺ T细胞绝对值在3组间差异无统计学意义。（4）Pearson相关分析显示，溶血发作组CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与血红蛋白浓度呈负相关（P<0.01），与总胆红素以及间接胆红素均呈正相关（P均<0.01），与网织红细胞比例呈正相关（P=0.01）；缓解组CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与血红蛋白浓度呈负相关（P<0.05）。（5）溶血发作组CD₄⁺ T细胞中CD₆₉ mRNA的相对表达水平显著高于缓解组（32.26±35.11比6.05±5.87，P<0.05）及健康对照组（1.76±1.85，P<0.01），缓解组高于健康对照组（P<0.05)。（6）溶血发作组患者血浆CD₆₉水平高于健康对照组[(494.21±16.06) ng/L比（441.39±104.6) ng/L，P<0.05]。

结论

AIHA/ES患者外周血CD₆₉⁺ T细胞比例增高，以CD₄⁺CD₆₉⁺ T细胞增高为主，且与AIHA/ES的疾病严重程度相关。

自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）系因免疫耐受异常产生抗自身红细胞抗体，致使红细胞破坏的一种血细胞减少症，合并免疫性血小板减少症（ITP）者为Evans综合征（Evans syndrome，ES），二者有共同的发病机制，研究发现T细胞及其分泌的细胞因子在免疫耐受异常中扮演重要角色^[1]。近期研究结果显示，C-型凝集素受体家族成员之一的CD₆₉分子不仅作为共刺激信号进一步增强细胞的活化或增殖分化，是免疫细胞活化的标志^[2]，而且CD₆₉及其配体Myl9可通过蛋白-蛋白之间的相互作用募集T细胞至炎症区域^[3]，CD₆₉还可以通过与树突状细胞上的配体Galectin-1相互作用负向调控Th17细胞的分化^[4,5]，及与S100A8/S100A9相互作用调控调节性T细胞的分化^[6]。AIHA/ES患者T细胞上CD₆₉的表达如何？CD₆₉⁺ T细胞与AIHA/ES是否有关联？本研究检测不同疾病状态的AIHA/ES患者和健康对照者的外周血CD₆₉⁺ T细胞，分析其与临床指标的相关性，同时检测CD₄⁺T细胞上CD₆₉ mRNA表达水平和血浆中CD₆₉浓度，初步了解T细胞在AIHA/ES中的活化状态，探寻AIHA/ES的免疫异常机制。

对象和方法

一、研究对象

32例AIHA/ES患者为天津医科大学总医院血液科2015年10月至2016年5月住院患者，根据国内诊断标准确诊^[7]。其中溶血发作组15例，男9例，女6例，中位年龄52（16~78）岁；缓解组17例，男10例，女7例，中位年龄46.5（15~78）岁。招募健康志愿者13名，男7名，女6名，中位年龄47（25~74）岁。研究方案经我院伦理委员会批准（批文号：2015-031-02），所有研究对象均签署知情同意书。

二、研究方法

1．试剂和仪器：

鼠抗人CD₃-APC、CD₄-FITC、CD₈-Percp、CD₆₉-PE、IgG₁-APC、IgG₁-FITC、IgG₁-Percp、IgG₁-PE、CD₁₉-APC、CD₅-FITC购自BD PharMingen公司；人外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；免疫磁珠CD₄单克隆抗体和MSC磁珠抗体分选柱购自德国美天妮公司；TRIzol和逆转录试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；CD₆₉ ELISA试剂盒购自Cloud-Clone公司。采用美国BD PharMingen公司的FACS Calibur型流式细胞仪、美国BIO-RAD公司IQ5型PCR仪和美国BioTek公司的ELx800型酶标仪进行检测。

2．流式细胞仪检测外周血CD₃⁺CD₄⁺、CD₃⁺CD₈⁺、CD₃⁺CD₆₉⁺、CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺、CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺细胞比例：

新鲜肝素抗凝外周静脉血100 ?l，分别取50 ?l标本于实验管及对照管，实验管中预先加入CD₃-APC、CD₄-FITC、CD₈-Percp、CD₆₉-PE各20 ?l，各自同型对照管预先加入IgG₁-APC、IgG₁-FITC、IgG₁-Percp、IgG₁-PE各20 ?l；4 ℃避光孵育30 min后加入1 ml溶血素，室温避光10 min，PBS洗两遍（加入1 ml PBS涡旋混匀，1 500转离心5 min后，去除上清，重复两遍）；加入300 ?l PBS悬浮细胞后上机检测，每管收集50 000个细胞，用CellQuest软件分析。

3．实时定量PCR检测外周血CD₄⁺T细胞内CD₆₉的表达：

取新鲜肝素抗凝外周静脉血5 ml；取淋巴细胞分离液分选出外周血单个核细胞，加入磁珠缓冲液洗涤，约1×10⁷个细胞中加入10 ?l CD₄抗体磁珠，40 ?l磁珠缓冲液混匀，4 ℃避光孵育5 min；再加入20 ?l CD₄磁珠抗体，30 ?l磁珠缓冲液，4 ℃避光孵育10 min；磁性条件下过柱子，脱离磁场收集细胞（CD₄⁺T细胞的分离纯度大于95%）。TRIzol法抽提T细胞总RNA，逆转录合成cDNA第一链；实时定量反应体系25 ?l；CD₆₉扩增反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 45 s，50个循环。每个标本设置复孔2个。PCR引物序列：CD₆₉，正向5' CATAGCTCTCATTGCCTTATCAGT 3'，反向5'CCTCTCTACCTGCGTATCGTTT 3'，目的片段长度254 bp；内参β-actin，正向5' CTGGAACGGTGGGTGACA 3'，反向5' AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA 3'，目的片段长度140 bp。CD₆₉相对表达量用2^-ΔΔCt表示。

4．ELISA法测血浆CD₆₉水平：

采集AIHA/ES患者及健康对照者抗凝的晨起空腹外周静脉血3~5 ml，离心后留取血浆。首先配制不同浓度标准品，设标准孔、待测样品孔和空白孔，均设复孔，依说明书检测，在450 nm处读取吸光度（A）值。制作CD₆₉标准曲线，使用拟合方程计算出相应CD₆₉浓度。

三、统计学处理

应用SPSS18.0统计软件进行数据分析。正态分布计量资料采用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用Dunnett-t检验；相关性检验采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组CD₃⁺CD₄⁺/CD₃⁺ T细胞比例、CD₃⁺CD₈⁺/CD₃⁺ T细胞比例及CD₄⁺/CD₈⁺细胞比值（表1）

CD₃⁺CD₄⁺/CD₃⁺及CD₃⁺CD₈⁺/CD₃⁺ T细胞比例在溶血发作组、缓解组和健康对照组间差异无统计学意义。溶血发作组的CD₄⁺/CD₈⁺细胞比值明显高于健康对照组（1.33±0.73比0.88±0.32，P=0.041)。

二、各组CD₃⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺、CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺和CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₈⁺ T细胞比例（表2，表3）

溶血发作组CD₃⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺ T细胞比例高于缓解组[(3.08±1.48)%比（1.96±1.33)%，P=0.031]和健康对照组[(1.28±0.83)%，P=0.001]，缓解组与健康对照组间差异无统计学意义。而CD₃⁺CD₆₉⁺T细胞绝对值在溶血发作组明显高于健康对照组[(2.94±1.81)×10⁷/L比（1.48±1.42)×10⁷/L，P=0.027]，溶血发作组与缓解组、缓解组与健康对照组间差异无统计学意义。

溶血发作组CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例高于缓解组[(2.16±1.56)%比（1.16±0.62)%，P=0.033]和健康对照组[(0.94±0.78)%，P=0.017]，缓解组与健康对照组间差异无统计学意义。CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺ T细胞绝对值在溶血发作组明显高于健康对照组[(1.04±0.98)×10⁷/L比（0.44±0.38)×10⁷/L，P=0.042]。

CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₈⁺ T细胞在溶血发作组比例高于健康对照组[(4.87±2.56)%比（1.83±1.27)%，P=0.001]，而在溶血发作组和缓解组、缓解组和健康对照组间差异无统计学意义。CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺ T细胞绝对值在三组间差异均无统计学意义。

三、CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与AIHA/ES患者各临床指标的相关性

AIHA/ES患者溶血发作组的外周血CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与血红蛋白浓度（Hb）呈负相关（r=－0.665；P=0.007），与网织红细胞比例（Ret%）、总胆红素（TBil）、间接胆红素（IBil）均呈正相关（r=0.644，P=0.010；r=0.787，P=0.001；r=0.769，P=0.001），而与网织红细胞绝对数、乳酸脱氢酶（LDH）、补体C₃、C₄等均无明显的相关性。

缓解组AIHA/ES患者的外周血CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与Hb呈负相关（r=－0.558，P=0.02），而与LDH、TBil、IBil、网织红细胞绝对数、Ret%、补体C₃、C₄等均无明显的相关性。

四、各组外周血CD₄⁺ T细胞中CD₆₉ mRNA的表达水平（图1）

注：溶血发作组和缓解组患者均为自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征

溶血发作组CD₄⁺ T细胞内CD₆₉ mRNA相对表达水平高于缓解组（32.26±35.11比6.05±5.87，P=0.01）及健康对照组（1.76±1.85，P=0.003），缓解组高于健康对照组（P=0.015）。

五、各组血浆中CD₆₉的浓度（图2）

注：溶血发作组和缓解组患者均为自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征

溶血发作组的血浆CD₆₉水平高于健康对照组[(494.21±16.06) ng/L比（441.39±104.6) ng/L，P<0.05]。

讨论

AIHA/ES是临床常见的免疫性血细胞减少症，患者体内存在异常的自身红细胞和/或血小板抗体，除B细胞功能亢进外，T细胞在免疫发病过程中发挥重要的作用。根据功能不同，T细胞分为辅助性T细胞（helper T lymphocyte，Th）、调节性T细胞（regulatory T lymphocyte，Treg）及细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。目前，除CTL与AIHA的关系尚未阐明以外，Th、Treg与AIHA关系的相关研究已经取得一定进展，证实Th和Treg在AIHA的发生、发展过程中扮演重要角色。Th主要辅助其他淋巴细胞发挥免疫作用，其数量增高、功能亢进在AIHA中起促进作用；Treg属负向调控细胞，其数量减低及功能异常可能打破免疫耐受，导致AIHA的发生^[1]。Th和Treg均为异质性细胞群，Han等^[8]研究证实CD₆₉⁺CD₄⁺CD₂^5－T细胞为新型的负调控细胞，不表达FoxP3，不分泌IL-10，通过膜表面高表达CD₁₂₂和细胞膜表面连接转化生长因子（TGF）-β₁发挥调控作用；Vitales-Noyola等^[9]发现CD₄⁺CD₆₉⁺NKG2D⁺细胞为免疫负调控细胞，通过分泌IL-10发挥调控作用；Rodríguez-Mu?oz等^[10]也发现自身免疫性甲状腺疾病患者中CD₆₉⁺调节性淋巴细胞数量增高，但其下调免疫的功能受损。这3项研究均证实CD₆₉⁺淋巴细胞为免疫抑制细胞，但调控免疫功能的方式不同。CD₆₉为早期活化诱导分子，在免疫调控中发挥着重要作用。静止期T细胞一般不表达CD₆₉^[11]，通过T细胞受体接受CD₃/TCR复合物、植物血凝素、蛋白激酶C激活物及佛波醇等刺激信号，1 h后细胞表面即有CD₆₉的表达，此后CD₆₉的表达迅速达到高峰，并可持续至72 h。CD₆₉在活化细胞中的快速表达并不仅仅作为一个标志分子，还可以作为共刺激信号进一步增强细胞的活化或增殖分化^[12]。

本研究中，虽然CD₃⁺CD₄⁺/CD₃⁺、CD₃⁺CD₈⁺/CD₃⁺ T细胞比例在AIHA/ES患者溶血发作组、缓解组和健康对照组之间差异无统计学意义，但是溶血发作组CD₄⁺/CD₈⁺细胞比值明显高于健康对照组，且差异有统计学意义，证实CD₄⁺T细胞的数量在AIHA/ES患者外周血中发生了变化；还发现溶血发作组患者外周血CD₃⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺ T细胞比例高于缓解组和健康对照组，其中以CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺ T细胞增高为主，CD₃⁺CD₈⁺CD₆₉⁺ T细胞在3组间差异无统计学意义。本研究显示，溶血发作组患者外周血CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺/CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例与患者的Ret%、TBil、IBil水平均呈正相关关系，能反映溶血及疾病的严重程度，CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺ T细胞在AIHA/ES发病中可能发挥重要作用。

本研究中应用磁珠分选AIHA/ES患者外周血CD₄⁺ T细胞，检测CD₄⁺ T细胞内CD₆₉ mRNA的表达水平，发现溶血发作组CD₄⁺ T细胞内CD₆₉ mRNA表达明显高于缓解组及健康对照组，缓解组高于健康对照组，证实AIHA/ES患者CD₄⁺ T细胞中CD₆₉ mRNA的表达增高。用ELISA方法检测发现，AIHA/ES溶血发作组CD₆₉血浆浓度高于健康对照组，差异有统计学意义，与用流式细胞术检测的CD₄⁺T细胞表面CD₆₉蛋白表达水平增高一致。三者均能证实CD₄⁺T细胞内的CD₆₉增高。

本研究发现AIHA/ES患者外周血中CD₆₉⁺ T细胞的数量增高，且CD₃⁺CD₄⁺CD₆₉⁺ T细胞水平与AIHA/ES疾病严重程度相关，需进一步探索CD₆₉⁺ T细胞对其他免疫细胞，如树突状细胞、Th17细胞及Treg增殖及功能的影响，以更深入了解AIHA/ES的免疫发病机制，寻找可能的生物治疗靶点。