类风湿关节炎（RA）是一个以累及周围关节为主的系统性炎症性自身免疫病。慢性滑膜炎症与骨质破坏为RA的主要病理特点。关节滑膜的慢性炎症、增生形成血管翳，侵犯关节软骨、骨和肌腱等，导致关节破坏，最终关节畸形和功能丧失^[1]。至目前为止，RA的发病机制尚未明确，治疗主要以非特异性治疗为主，故不能从根本上控制滑膜炎症的发生和骨质破坏的进展。近年来有研究认为，神经导向分子Semaphorin 5A（Sema 5A）可能参与了RA的发病过程^[2]。Sema 5A作为Sema家族中的一种外分泌蛋白，其最早的功能定位是神经轴突导向分子，而引起人们广泛关注的是Sema 5A与细胞迁移、肿瘤生长、血管生成及免疫调节等多种病理生理现象密切相关^[3,4,5,6]。Gras等^[2]的研究显示，Sema 5A可通过促进T细胞、自然杀伤细胞增殖及诱导辅助T细胞1/辅助T细胞17炎性细胞因子分泌参与RA发病。本研究通过检测RA患者血清中Sema 5A水平，分析其在RA发病中的作用，并在体外实验中检测其对破骨细胞形成的影响，为Sema 5A在RA发病机制中的作用提供更多的实验依据。

1．RA组：选2016年3—12月浙江大学医学院附属第二医院风湿科住院RA患者62例，男性15例，女性47例，年龄（59.5±10.5）岁，病程2~360个月，中位病程72个月。RA诊断符合2010年美国风湿病学会（ACR）修订的RA分类标准^[7]。患者双手摄X线片，收集患者健康评估问卷（HAQ）、类风湿因子（RF）滴度、抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体滴度、红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白、以CRP计算的28个关节疾病活动度（DAS28-CRP）、RA临床疾病活动指数（CDAI）、影像学Sharp评分。DAS28-CRP> 5.1分或CDAI > 22为RA高疾病活动度，DAS28-CRP ≤ 5.1分或CDAI ≤ 22为RA中低疾病活动度。

2．骨关节炎（OA）组：选同期住院OA患者30例，男性2例，女性28例，年龄（56.1±11.7）岁，病程5~480个月，中位病程48个月。OA诊断符合2012年ACR修订的OA分类标准^[8]。

3．健康对照组：选同期浙江大学医学院附属第二医院职工体检者48例，男性12例，女性36例，年龄（59.8±14.3）岁。排除RA、OA、系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性硬化、肌炎/皮肌炎等病史。

4．所有研究对象均来自无血缘关系的浙江地区汉族人群，本研究获得浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准（批文号2016-203），并取得了研究对象的知情同意。

1．所有受试者清晨空腹采集静脉全血2 ml，4 ℃放置，自然凝固后于离心半径20 cm、3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃低温冰箱保存。

2．Sharp评分：RA组患者均行双手X线检查，由浙江大学医学院附属第二医院放射科医生对骨质疏松及骨侵蚀程度进行评分，评分标准参见文献[9]。

3．血清Sema 5A水平检测：利用武汉基因美生物技术有限公司提供的商品化试剂盒，采用酶联免疫吸附（ELISA）法同批检测受试者的血清Sema 5A水平。方法和步骤如下:已包被抗Sema 5A抗体的微孔板中加入血清100 μl室温孵育2 h，冲洗3次，加入100 μl抗人IgG室温孵育30 min，再次冲洗3次后加入100 μl底物显色剂，室温、避光孵育15 min，每孔加入50 μl终止液，在30 min内用550型酶标仪（Bio-RAD公司）以450 nm测吸光度（A）值，绘制标准曲线，计算相应的Sema 5A浓度。

4．细胞培养：小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞由浙江大学医学院附属第二医院临床实验中心馈赠。RAW264.7细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养。

5．破骨细胞诱导与鉴定：培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，5×10⁴/孔接种于24孔板，以加入磷酸盐缓冲液（PBS）为阴性对照组，以核因子-κB受体活化因子配基（RANKL）（100 ng/ml）为阳性对照组，不同浓度Sema 5A（0、0.5、1、2.5、5 μg/ml）为实验组，每3天换液，并加入上述细胞因子或蛋白。培养7 d后，应用4%多聚甲醛固定细胞，行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，具体操作按照说明书进行，观察TRAP染色阳性细胞数。实验组与对照组分别在100倍视野下随机选取10个视野计数TRAP染色阳性细胞（细胞核≥ 3个），10个视野的平均数为该培养孔的破骨细胞数。上述实验重复3次。

6．实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测TRAP、组织蛋白酶-K、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表达：细胞诱导7 d后，收集细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，引物由上海生工生物公司合成。目的基因引物序列如下：TRAP上游引物5′CAGCAGCCAAGGAGGACTAC 3′，下游引物5′ACATAGCCCACACCGTTCTC 3′；组织蛋白酶-K上游引物5′CAGCTTCCCCAAGATGTGAT 3′，下游引物5′AGCACCAACGAGAGGAGAAA 3′；MMP-9上游引物5′AAACCAGACCCCAGACTCCTCTCT 3′，下游引物5′GAGGACACAGTCTGACCTGAACCA 3′；GAPDH上游引物5′AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA 3′，下游引物5′AATGAAGGGGTCATTGATGG 3′。逆转录反应体系、实时荧光定量PCR扩增体系及反应条件按照试剂盒说明书设定。反应完成后行扩增曲线和熔解曲线分析。

7．骨吸收实验及骨吸收陷窝分析：将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞接种于96孔板中的预置无菌骨片上，接种密度为2 × 10⁴/cm²，待贴壁后分别加入PBS、100 ng/ml RANKL、5 μg/ml Sema 5A刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，每3天换液，诱导7 d后将骨片取出，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）将薄骨片上的破骨细胞消化，2.5%戊二醛固定30 min，PBS超声清洗3次（5 min/次），乙醇梯度脱水，每张骨片随机选取10个视野（200倍），区域之间无重叠，计算骨吸收陷窝个数。

采用SPSS16.0软件进行分析。全部数据行Kolmogorov-Smimov检验判断是否正态分布。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较应用t检验；不符合正态分布的计量数据以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

RA组患者HAQ评分为（4.3±1.5）分，ESR（64.7±33.1）mm/1 h，CRP（4450±407）mg/L，IgA（2.5±1.7）g/L，IgG（15.7±5.2）g/L，IgM（2.5±1.5）g/L，DAS28-CRP为（5.6±1.3）分，Sharp评分为（38.6±14.8）分，RF阳性58例（93.5%），抗CCP抗体阳性47例（75.8%）。WBC<4×10⁹/L者10例，血红蛋白<110 g/L者33例。RA高疾病活动度者28例，RA中低疾病活动度者34例。OA组患者，RF阳性2例（6.7%）。

见表1，RA组患者血清Sema 5A水平高于健康对照组、OA组，差异有统计学意义（P<0.05）。抗CCP抗体阳性RA患者血清Sema 5A水平高于阴性者（P<0.05）；RA高疾病活动度者血清Sema 5A水平高于中低疾病活动度者（P<0.05）。

RA患者血清Sema 5A水平与CRP、DAS28-CRP、CDAI及Sharp评分呈正相关（r值分别为0.519、0.273、0.448、0.292，P<0.05或P<0.001），与ESR、IgG、IgM、IgA、白细胞计数、血小板计数、RF滴度均无相关性（r值分别为0.199、0.093、-0.057、-0.064、0.039、-0.04，P>0.05）。

TRAP染色结果显示，随着Sema 5A浓度增加，TRAP染色阳性细胞数逐渐增多（图1）。5 μg/ml Sema 5A刺激后TRAP染色阳性细胞数[（24.0±4.49）/孔]较空白[（3.25±0.63）/孔]显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）；5 μg/ml Sema 5A与RANKL比，TRAP染色阳性细胞数差异无统计学意义，见表2。

见表3，RANKL组TRAP、组织蛋白酶-K、MMP-9 mRNA表达均升高（P < 0.05）。Sema 5A能诱导破骨细胞TRAP、组织蛋白酶-K、MMP-9 mRNA表达上调；随着Sema 5A浓度升高，TRAP、组织蛋白酶-K、MMP-9 mRNA表达均升高，与空白比，5 μg/ml Sema 5A的TRAP mRNA表达差异有统计学意义（P < 0.05）。

亚甲胺蓝染色结果显示（图2），与空白对照[（0.67±0.33）/孔]比，5 μg/ml Sema 5A骨吸收陷窝个数增多[（9.25±1.85）/孔]，差异有统计学意义（P < 0.05）。与RANKL[（14.5±1.61）/孔]比，5 μg/ml Sema 5A骨吸收陷窝个数减少，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

Sema家族蛋白是以半胱氨酸富集区域为特征的一组分泌性或膜相关性的糖蛋白，是重要的神经轴突导向分子，在神经发育过程中对轴突的导向、神经纤维成束、细胞迁移以及神经细胞的损伤修复起重要作用^[10,11]。研究发现，Sema家族至少含有20个成员。根据其种系发生与结构特征可分为8类，其中3~7类是脊椎动物特有。所有Sema家族成员在其N端均有一个保守的由约500个氨基酸残基组成的"Sema"结构^[12]。

越来越多的研究发现，Sema家族成员在神经系统以外的多种组织和器官均有分布，其分别与细胞迁移、肿瘤生长、血管生成以及免疫应答等多种生理、病理现象密切相关，并参与了多种自身免疫病的发生发展过程^[13,14,15]。随着Sema家族蛋白在免疫系统中的研究逐渐增多，结果发现该家族蛋白可参与调节免疫应答各个阶段，研究者们甚至称之为"免疫Semaphorins"，并针对该家族蛋白在自身免疫病中的作用机制进行研究。

Sema 5A是Sema家族中的一员。研究发现，Sema 5A可通过活化T细胞、自然杀伤细胞参与RA的发病，可溶性Sema 5A还可能成为诊断RA的血清学标志物^[2]。本研究发现，RA组患者血清Sema 5A水平显著高于健康对照组和OA组，且RA组患者抗CCP抗体阳性者血清Sema 5A水平显著高于阴性者，差异有统计学意义，这一结果与国外文献报道一致^[2]，提示Sema 5A在炎症环境中升高。进一步相关分析显示，RA组患者血清Sema 5A水平与CRP、DAS28-CRP、CDAI、Sharp评分呈正相关，但与ESR、免疫球蛋白、白细胞计数、血小板计数、类风湿因子滴度均无相关性，提示Sema 5A与炎症相关，在RA的病情活动和骨质破坏中具有重要作用，外周血Sema 5A水平可作为评价RA病情的辅助指标。

破骨细胞源于单核巨噬细胞，能降解骨基质，在骨代谢中起重要作用。小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞在RANKL刺激下能分化为多核破骨细胞。在对破骨细胞研究中，小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞被视为破骨细胞前体细胞而广泛应用。因TRAP在破骨细胞内高表达，被认为是破骨细胞特异性标志物，能反映破骨细胞成熟度及活性。组织蛋白酶-K和MMP-9也高表达于破骨细胞，作为胶原溶解酶，二者在破骨细胞发挥骨吸收功能时起重要作用。完全分化成熟的破骨细胞具有多核、TRAP染色阳性及高表达TRAP、组织蛋白酶-K、MMP-9的特点。本研究采用Sema 5A刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，发现随着Sema 5A浓度增加，TRAP染色阳性的破骨细胞数增加，破骨细胞相关基因TRAP、组织蛋白酶-K、MMP-9 mRNA表达增加，且呈剂量依赖性，提示Sema 5A可促进小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化。

基于上述实验结果，5 μg/ml Sema 5A诱导破骨细胞形成个数最多，破骨细胞相关基因mRNA水平表达升高最显著。因此，本研究以5 μg/ml Sema 5A诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分化，诱导体系中预先加入商品化小牛骨骨片，设置空白及阳性对照，培养7 d后观察骨吸收陷窝个数。结果显示，与空白对照比，5 μg/ml Sema 5A骨吸收陷窝个数显著增加，差异有统计学意义，提示Sema 5A促进小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化，同时生成的破骨细胞骨吸收功能增强。

综上所述，Sema 5A在RA患者血清中显著升高，可提示疾病活动度及骨破坏程度。体外实验发现，Sema 5A可以在无RANKL参与的情况下直接促进小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化，为进一步研究Sema 5A在RA骨破坏机制的作用提供了实验依据。