胰腺β细胞功能障碍和数量减少是2型糖尿病的主要发病机制^[1,2]，其发生与胰岛淀粉样蛋白沉积有密切关系^[3]。胰岛淀粉样蛋白主要由胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）聚合形成。人IAPP（hIAPP）可自发聚合形成毒性寡聚体^[4]，以往研究证实hIAPP可在体内及体外对β细胞和胰岛产生毒性损伤作用^[5,6]，但其机制尚未完全明确。研究hIAPP致β细胞损伤的机制，防止hIAPP所致β细胞的损伤作用对于延缓2型糖尿病的发病和进展有重要意义。氧化应激在hIAPP致β细胞损伤过程中起关键作用，氧化应激还与细胞自噬有着密切的关系，活性氧族（reactive oxygen species，ROS）是自噬的重要诱导因子^[7]。自噬是一种细胞的自我稳态机制，对于维持β细胞数量和功能也发挥着重要作用^[8]。目前对于hIAPP对β细胞自噬的影响及相关机制和细胞通路、自噬与hIAPP所诱导的氧化应激之间的关系了解均较少。因此，我们通过体外实验观察hIAPP影响大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS-1细胞）自噬的通路与机制及自噬对hIAPP所诱导的细胞毒性和氧化应激的影响，为2型糖尿病的治疗寻找新的靶点。

INS-1细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。hIAPP、大鼠胰岛淀粉样多肽（rat IAPP, rIAPP）、compound C、磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺（AICAR）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）、噻唑蓝（MTT）等试剂购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国MRC公司，抗-LC3B、抗磷酸化-AMPKα（Thr172）、AMPK α1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体、p62抗体购自美国Affinity公司。ROS测定试剂盒购自中国南京建成公司。

INS-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃，5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。hIAPP、rIAPP、compound C由二甲基亚砜（DMSO）按相应浓度稀释, 3-MA、AICAR由PBS缓冲液按相应浓度稀释，在细胞干预前，预先使用无血清培养基培养同步化，加入同体积药物溶剂DMSO（DMSO<0.1%）作为阴性对照组，分别给予hIAPP（10 μmol/L）、rIAPP（10 μmol/L）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、AICAR、compound C、3-MA单独孵育细胞24 h。分别给予NAC、NH₄Cl、AICAR、compound C、3-MA预孵育细胞2 h，然后予hIAPP（10 μmol/L）共同孵育细胞24 h。

INS-1在2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液4℃固定过夜，二甲砷酸钠缓冲液充分洗涤，四氧化锇再固定，使用乙醇脱水后由环氧树脂包埋。然后切片由醋酸双氧铀染色，由电子显微镜（日本Hitachi公司）进行检测。

细胞活力采用MTT法测定，INS-1接种于96孔板中，在37 ℃饱和湿度环境中培养48 h，然后给予干预条件处理，实验重复进行3次。干预孵育后，每孔加入20 μl MTT溶液（使用PBS缓冲液配成5 mg/ml浓度）孵育4 h，移除培养基，每个干预条件组设5个复孔，每孔加入200 μl的DMSO溶液以溶解甲瓒，然后使用分光光度计测定570 nm各孔吸光度值。

细胞在给予相应干预后，使用0.25%胰酶消化，加入无酚红培养液终止消化制成细胞悬液，离心收集细胞使用PBS洗涤后重悬，加入二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）探针孵育，在荧光显微镜及酶标仪（美国Thermo公司）中检测2,7-二氯荧光素（DCF）荧光强度（采用激发波长485 nm，发射波长525 nm）。

干预后的细胞4 ℃离心后收集，PBS冰盐水洗涤，然后裂解，4 ℃离心30 min，取上清液－80 ℃保存。蛋白样品浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。蛋白样品由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜，含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h，相应一抗孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，辣根过氧化物酶（HRP）二抗孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次，ECL化学发光法显影，免疫印迹条带灰度由Image J软件定量分析。

使用SPSS 20.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，采用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

通过电子显微镜观察，每组随机记录20个细胞内自噬体数目并进行比较，如图1所示，hIAPP组INS-1细胞内自噬体数目较对照组显著增多（P<0.01)，而rIAPP组细胞内自噬体数目与对照组比较差异无统计学意义。使用western blot对自噬标志物进行检测，如图2所示，hIAPP组微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平较对照组显著升高，p62显著减低（P值均<0.05)。NH₄Cl+hIAPP组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62水平均较hIAPP组显著升高（P值均<0.05)。rIAPP组及NH₄Cl+rIAPP组其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62水平与对照组比较差异均无统计学意义。

注：rIAPP为大鼠胰岛淀粉样多肽；hIAPP为人胰岛淀粉样多肽；INS-1细胞为大鼠胰岛细胞瘤细胞；LC3为微管相关蛋白1轻链3；与对照组比较，^aP<0.05；与hIAPP组比较，^bP<0.05

对INS-1细胞ROS水平进行测定，如图3所示，hIAPP组其ROS水平为对照组的1.76倍，差异具有统计学意义（P<0.01)，而rIAPP组的ROS水平与对照组比较差异无统计学意义。还原剂NAC组其ROS水平与对照组差异无统计学意义，NAC+ hIAPP组ROS水平为对照组的1.23倍，明显低于hIAPP组（P<0.05)。如图4所示，对照组与NAC组其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62表达差异无统计学意义，提示NAC单独孵育未对INS-1细胞自噬产生影响。与hIAPP组比较，NAC+hIAPP组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著降低（P<0.05)，p62表达显著升高（P<0.05)。

注：NAC为N-乙酰半胱氨酸；rIAPP为大鼠胰岛淀粉样多肽；hIAPP为人胰岛淀粉样多肽；INS-1细胞为大鼠胰岛细胞瘤细胞；LC3为微管相关蛋白1轻链3；与对照组比较，^aP<0.05；与hIAPP组比较，^bP<0.05

如图5所示，与对照组比较，hIAPP组INS-1细胞磷酸化AMPK水平明显增高，差异具有统计学意义（P<0.05)。rIAPP组磷酸化AMPK表达与对照组比较差异无统计学意义。与hIAPP组比较，NAC+hIAPP组磷酸化AMPK的表达明显降低（P<0.05)。图6显示，与对照组比较，AMPK抑制剂compoud C单独孵育INS-1细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62水平差异无统计学意义，AICAR孵育组和hIAPP孵育组磷酸化AMPK表达水平显著增高（P<0.05)，同时其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平也明显增高（P<0.05)，p62表达显著减低（P<0.05)。compound C+hIAPP组其磷酸化AMPK和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均较hIAPP(10μmol/L）组明显降低（P<0.05)，p62表达显著升高（P<0.05)。Compound C+AICAR组其磷酸化AMPK和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均较AICAR单独孵育组明显降低（P<0.05)，同时p62表达显著升高（P<0.05)。

注：INS-1细胞为大鼠胰岛细胞瘤细胞；AMPK为AMP依赖的蛋白激酶；p-AMPK为磷酸化AMPK；rIAPP为大鼠胰岛淀粉样多肽；hIAPP为人胰岛淀粉样多肽；NAC为N-乙酰半胱氨酸；与对照组比较，^aP<0.05，与hIAPP组比较，^bP<0.05

注：C.C为compound C；AICAR为AMP依赖的蛋白酶激酶激动剂；hIAPP为人胰岛淀粉样多肽；AMPK为AMP依赖的蛋白激酶；p-AMPK为磷酸化的AMPK；LC3为微管相关蛋白1轻链3；与对照组比较，^aP<0.05；与hIAPP组比较，^bP<0.05；与AICAR组比较，^cP<0.05

表1显示，3-MA组、compound C组及AICAR组其INS-1细胞活力与对照组比较，差异均无统计学意义。hIAPP组细胞活力较对照组显著降低（P<0.01)。3-MA+hIAPP组和compound C+hIAPP组细胞活力均显著低于hIAPP组（P值均<0.05)。hIAPP+AICAR组其细胞活力显著高于hIAPP组（P<0.05)。图7显示，光镜下可观察到hIAPP孵育可使INS-1细胞出现收缩、变圆、从聚集生长的细胞团和培养板壁脱离等形态学异常，而3-MA可加重hIAPP所孵育细胞的这些形态学异常。图8显示，与对照组比较，3-MA组、compound C组及AICAR组细胞ROS水平无明显变化。与hIAPP组比较，3-MA+hIAPP组和compound C+hIAPP组ROS水平明显升高（P值均<0.05)，而AICAR+hIAPP组ROS水平显著降低（P<0.05)。

胰岛淀粉样蛋白沉积是2型糖尿病患者的重要病理特征，而hIAPP是胰岛淀粉样蛋白的主要成分^[9]。hIAPP可自发聚集形成毒性寡聚体对细胞产生毒性作用，与胰腺β细胞数量减少及功能障碍密切相关^{[3,4,5,6,7,8,9,10]}。与hIAPP不同，rIAPP由于20~29区域氨基酸残基差异，以单体形式存在没有聚集形成淀粉样蛋白的能力，也不会对β细胞产生毒性^[11]。在本研究中，我们发现hIAPP可通过增加ROS水平激活AMPK通路促进β细胞自噬。

自噬是一种重要的细胞保护机制，使细胞能够在损伤和应激情况如缺氧、营养缺乏时存活^[12]。在自噬过程中细胞内会由一种双层膜结构包裹损伤细胞器和异常蛋白质形成自噬体，自噬体再与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解其内容物^[12]。研究表明自噬在维持β细胞功能和数量方面起重要作用^[8]，自噬诱导剂雷帕霉素可减轻棕榈酸引起的β细胞损伤^[13], β细胞自噬相关基因（autophagy related gene, Atg)7特异性敲除小鼠会出现β细胞增殖减少及死亡增加，空腹胰岛素分泌水平降低和血糖升高及糖耐量受损^[14]。自噬在有些情况下也可导致细胞死亡^[15]，故其所扮演的角色会视细胞和细胞所处的环境不同而发生改变。LC3是自噬标志物，LC3通过加工形成可溶性的LC3-Ⅰ，然后转变为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜上，LC3-Ⅱ量可以反映自噬水平^[16]。p62可通过LC3与自噬体结合并降解，p62量与自噬活性负相关^[16]。本实验中，电镜可观察到hIAPP组INS-1细胞内自噬体形成增多，同时其自噬标志物LC3-Ⅱ水平显著升高，p62降低。而使用氯化铵阻断自噬体与溶酶体融合降解后，可进一步增加hIAPP组的LC3-Ⅱ和p62水平。这些结果说明hIAPP可促进INS-1细胞自噬。而rIAPP组其细胞内自噬体数量及自噬标志物表达与对照组没有显著差异，提示hIAPP可促进INS-1细胞自噬作用与其聚合形成毒性寡聚体相关，与IAPP单体作用于细胞受体无关。

ROS是介导氧化应激的重要因子，过量的ROS可造成细胞结构和DNA损伤，脂质过氧化及蛋白变性，通过激活凋亡通路导致细胞死亡^[17]。ROS也可作为信号分子参与调节细胞增殖、凋亡、自噬等病理生理过程^[18]。胰岛β细胞由于抗氧化酶系相对较弱，对氧化损伤尤为敏感^[19]。氧化应激也是hIAPP细胞毒性作用的关键机制之一^[20,21]。与先前研究相一致，在本研究中hIAPP可显著增加INS-1细胞的ROS水平^[22]。NAC是一种强抗氧化剂，具有直接清除ROS的能力。本研究中单独NAC孵育INS-1细胞自噬标志物表达与对照组差异无统计学意义，提示NAC并不直接影响INS-1细胞自噬；但NAC与hIAPP共同孵育在降低细胞ROS水平的同时也抑制hIAPP所诱导的LC3-Ⅱ表达，使p62水平升高，这说明hIAPP促进INS-1细胞自噬与其诱导氧化应激相关。目前对于ROS诱导细胞自噬的分子机制了解仍较少，AMPK被称为细胞的能量与营养的感受器，是自噬调节的重要因子，AMPK可通过活化结节性硬化复合物（tuberous sclerosis comlex，TSC)1/2，导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）通路被抑制从而启动自噬^[23]。但也有研究表明，激活AMPK可负性调节自噬^[24]，所以AMPK对自噬的调节与细胞种类和干预环境相关。在氧化应激条件下，AMPK是调节自噬的重要通路^[25]。本研究中，实验结果显示hIAPP孵育可明显促进AMPK的磷酸化活化，而此作用可被抗氧化剂NAC所抑制，且NAC单独孵育不影响磷酸化AMPK的水平，这说明hIAPP可通过诱导氧化应激介导AMPK的激活。rIAPP组其磷酸化AMPK水平与对照组差异无统计学意义，提示AMPK活化与IAPP单体的作用无关。使用AMPK激活剂AICAR可促进INS-1细胞AMPK磷酸化和LC3-Ⅱ表达，使p62水平降低。而AMPK通路特异性抑制剂compound C可阻断hIAPP及AICAR所诱导的AMPK磷酸化活化，同时也抑制LC3-Ⅱ表达，使p62水平升高。以上结果表明AMPK是调控INS-1细胞自噬的重要通路，hIAPP通过活化AMPK促进INS-1细胞自噬。

受损细胞器如线粒体是应激损伤情况下ROS生成的重要来源^[26]。自噬可降解损伤的线粒体，减少ROS的生成减轻氧化应激，也可清除氧化变性的蛋白质减轻其对细胞的毒性作用^[26]。虽然自噬可拮抗氧化应激，但在一些情况下自噬反而加重细胞的氧化损伤^[27]，故自噬对氧化应激的影响会视细胞种类和干预条件不同产生差异。在本研究中，hIAPP可促进INS-1细胞死亡并使细胞内ROS水平增高。使用自噬抑制剂3-MA阻断自噬后，可使hIAPP所孵育INS-1细胞ROS水平进一步增加，致更多细胞死亡。这些结果提示自噬是β细胞应对hIAPP毒性的一种适应性反应，抑制自噬可加重hIAPP所诱导的氧化应激减轻及对INS-1细胞的毒性损伤作用。AMPK抑制剂compound C阻断AMPK通路也可增加hIAPP所孵育细胞ROS水平，同时加重hIAPP对细胞的毒性作用。AMPK通路的激动剂AICAR在促进INS-1细胞自噬的同时，也明显减少hIAPP所诱导的ROS生成并减轻其毒性作用。这些结果提示AMPK通路也在hIAPP的毒性损伤中发挥重要作用，激活AMPK通路在促进自噬的同时，可显著减轻hIAPP所诱导的氧化应激和细胞死亡。而抑制AMPK通路可加重hIAPP对INS-1细胞的毒性作用。

综上，在hIAPP对INS-1细胞的毒性损伤中，自噬可拮抗氧化应激，对细胞发挥保护作用。激活AMPK可通过诱导自噬，减轻hIAPP对INS-1细胞的损伤。这为进一步了解hIAPP对β细胞损伤的机制以延缓2型糖尿病β细胞衰竭提供了新思路。