胆红素在肺气肿动物模型中发挥保护作用的机制研究
2016年8月
中华结核和呼吸杂志，第39卷第8期 第637页-第641页
蔚京京|赵卉|李建强
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慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是呼吸系统最常见的慢性疾病之一，近年来其发病率和病死率逐年上升，已经成为危害人类身体健康、加重社会经济负担的主要公共卫生问题[1,2]。慢阻肺的发病机制与炎症和氧化应激等密切相关。目前普遍认为烟草烟雾暴露(包括主动吸烟和被动吸烟)是慢阻肺的重要发病因素，烟草烟雾中的有害烟雾颗粒和气体可导致肺组织的炎症及氧化应激反应[3,4,5,6]。而炎症和氧化应激反应与NF-κB和MAPK的调控密切相关[7,8,9]。
动物模型建立：8周龄健康Wistar雄性大鼠30只(购自北京市昌扬西山养殖场，饲养于山西医科大学微免教研室动物房)，体重150～200 g，随机分为3组：对照组、烟雾暴露组、胆红素组，每组10只。烟雾暴露组和胆红素组大鼠在烟雾暴露装置中(PAB-S200，北京佰乐良科技有限公司，中国)每日熏烟1次，每次燃烧20支猴王牌烟草(宝鸡卷烟厂，焦油含量11 mg/支，烟碱含量1.1 mg/支)，每支10 min，换烟时停止熏烟5 min。每周熏烟6 d，连续熏12周。烟雾暴露装置中设置烟雾和空气比为1∶6并维持氧气浓度为(21±1)%。胆红素组在每日熏烟之前1 h给予间接胆红素溶液灌胃(20 mg·kg－1·d－1，溶解于0.1 N NaOH溶液，调节pH值为7.4，用生理盐水稀释至终体积，0.5 ml/只)，1次/d。另外，烟雾暴露组和对照组分别予以生理盐水灌胃，方法同胆红素干预组。3组动物均自由饮食饮水，于12周末处死动物，取材检测[10]。
标本收集及模型检验：将动物用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，抽取腹主动脉血8～10 ml后处死。血液室温静置1 h，充分凝固，离心取上清，－20 ℃保存待测[10]。
夹闭右主支气管，用2 ml 4 ℃预冷的无菌生理盐水灌洗左肺3次，回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。将混匀的BALF滴于细胞计数板上在显微镜下进行计数。剩余BALF于4 ℃离心后，取上清保存待测；将沉淀涂片，瑞氏染色后进行细胞分类计数。
将右下肺组织泡入10%甲醛溶液中固定48 h。常规石蜡包埋，切成3 mm薄片，HE染色，光镜下观察肺组织病理改变并进行肺气肿形态学评价，测量平均内衬间隔(MLI)、单位面积平均肺泡数(MAN)和平均肺泡面积(MAA)[11]，检验模型建立成功与否。余肺保存待测。
称取100 mg保存的肺组织并剪碎，按照重量(g)体积(ml)比为1∶9的比例加入0.9 ml的生理盐水中，冰上操作进行超声匀浆，将其制成10%的肺组织匀浆液，3 000 r/min离心10 min取上清。
酶联免疫吸附方法检测BALF、血清和肺组织匀浆上清中相关炎症因子(IL-17，IL-8，TNF-α)的水平，按照相应的试剂盒(均购自美国eBioscience)说明书进行操作检测。
使用相应的试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)检测氧化应激指标(氧化产物丙二醛MDA和超氧化物歧化酶SOD)，操作按照说明书进行。
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶联结法(SP法)检测肺组织NF-κBp65、MAPKp38和p-p38的表达(具体操作按照说明书进行)。一抗为兔抗大鼠多克隆NF-κBp65、MAPKp38和p-p38抗体，二抗为生物素山羊抗兔IgG。阳性表达为细胞核(NF-κBp65和p-p38)或胞浆(MAPKp38和p-p38)呈棕黑色或棕黄色颗粒状改变。阴性对照标本用0.01 mol/L PBS液代替一抗进行染色，其余相同。每张切片随机选取5个视野，应用BI-2000医学图像分析系统检测其灰度值。灰度值越大，表达越低。
称取一定量的肺组织，剪碎后加入RIPA蛋白裂解液(碧云天，中国)，在冰上使用超声匀浆器匀浆后，4 ℃离心取上清，用BCA蛋白浓度检测试剂盒(碧云天，中国)检测所提取的总蛋白浓度。按Western blot蛋白电泳方法经SDS-PAGE电泳后湿转PVDF膜，室温下5% BSA封闭液封闭2 h，分别加入兔抗大鼠核因子-κBp65、p38和p-p38抗体(1∶1 000，Abcam，USA)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP-羊抗兔二抗(1∶2 000，博士德，武汉)孵育2 h，洗膜后将膜置于ECL发光混合液(A，B试剂各0.5 ml混合，碧云天，中国)，放入全自动凝胶成像分析仪(Bio-Rad，USA)曝光照相。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料结果以
±s表示，单因素方差分析P<0.05表示总体具有统计学意义，再用LSD检验进行两组均数间比较。
动物一般状态：对照组大鼠精神状态良好，灵活喜动，对外界刺激反应敏捷，抓取时逃避，毛发整齐有光泽，体重增长正常，呼吸、饮食、大便无异常。烟雾暴露组大鼠精神萎靡不振，蜷缩成团，抓取时躲避慢，毛发杂乱干枯，排稀便，体重增长缓慢，熏烟时出现呼吸急促。胆红素组大鼠症状与烟雾暴露组大鼠症状相似，但严重程度较之减轻。
肺组织病理切片观察(图1图2图3图4图5图6)、肺气肿评价(表1)、支气管肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞计数(表2)验证模型建立成功，相关炎症因子(表3，表4)和氧化应激状态(表5)的检测表明烟草烟雾暴露引起肺组织的炎症和氧化应激反应，而胆红素干预可以对肺组织起到抗炎抗氧化的保护作用[10]。
三组大鼠肺气肿评价比较 (
±s)
三组大鼠肺气肿评价比较 (
±s)
注：a与对照组比P<0.05，b与烟雾暴露组比P<0.05
三组大鼠BALF炎性细胞分类计数比较 (×104个/ml，
±s)
三组大鼠BALF炎性细胞分类计数比较 (×104个/ml，
±s)
注：a与对照组比较P<0.05，b与烟雾暴露组比较P<0.05
三组大鼠血清、肺组织匀浆及BALF中IL-17含量(pg/ml，
±s)
三组大鼠血清、肺组织匀浆及BALF中IL-17含量(pg/ml，
±s)
注：a与对照组比较P<0.05，b与烟雾暴露组比较P<0.05
三组大鼠血清及BALF中IL-8和TNF-α含量(pg/ml，
±s)
三组大鼠血清及BALF中IL-8和TNF-α含量(pg/ml，
±s)
注：a与对照组比较P<0.05，b与烟雾暴露组比较P<0.05
三组大鼠血清及肺组织匀浆中MDA和SOD含量 (
±s)
三组大鼠血清及肺组织匀浆中MDA和SOD含量 (
±s)
注：a与对照组比较P<0.05，b与烟雾暴露组比较P<0.05
Western blot和免疫组化结果：可见p38在各组表达无明显差异，烟雾暴露组NF-κBp65和p-p38表达较高，胆红素组较低(图7图8图9图10图11图12图13图14图15图16，表6)。
各组NF-κBp65、MAPKp38和p-p38免疫组化灰度值比较 (
±s)
各组NF-κBp65、MAPKp38和p-p38免疫组化灰度值比较 (
±s)
注：a与对照组比较P<0.05，b与烟雾暴露组比较P<0.05
本研究结果发现胆红素干预在大鼠肺气肿发生过程中，通过抑制NF-κBp65和MAPKp38的激活和表达从而抑制炎症和氧化应激损伤，减轻肺部病理改变，对肺组织表现出抗炎抗氧化的保护作用。
NF-κB是一个二聚体转录因子，普遍存在于真核细胞内，由Rel家族成员组成，包括Rel-A(即p65)、Rel-B、Rel-C、p50和p52。最常见的NF-κB二聚体是p65与p50组成的异二聚体。NF-κB是多种信号通路的汇聚点，是氧自由基发挥损伤作用的敏感靶因子，参与炎症免疫反应的许多分子如TNF-α、IL-8、TGF-β等都受NF-κB的调控 [7,8,12,13,14]。在正常情况下，NF-κB与其抑制单位IκB结合，并被IκB覆盖核定位区域而不能向细胞核内转移。当机体受到损伤性刺激时，I-κB发生磷酸化并和NF-κB分离，使得NF-κB得以转位入核，与目的基因启动子上的κB位点结合，启动目的基因的转录[7,15]。
位于细胞质中的NF-κB可被多种因素激活，其中炎症和活性氧起着重要的作用，而抗氧化剂可以通过影响细胞的氧化还原状态抑制NF-κB的激活[15]。众多研究显示NF-κB的激活在慢阻肺的发生发展中起着重要的作用。长期大量烟雾刺激可使NF-κB过度激活，促进炎症因子的表达，引起中性粒细胞趋化和活化，造成炎症迁延不愈，日趋渐重[16]。在肺功能正常的吸烟受试者和慢阻肺患者支气管黏膜活检中也发现，NF-κB的表达增高与疾病的严重程度呈正比[17]。这些研究结果与本研究基本一致，Western blot和免疫组化结果都显示，由于炎症刺激和氧化应激的作用，烟雾暴露组p65表达增高。而胆红素作为一种抗氧化剂，可以抑制炎症和氧化应激反应从而抑制肺气肿的发生发展，这可能与其抑制了NF-κBp65的表达有关。既往研究已经证实胆红素在急性肺损伤模型中可以抑制NF-κB的激活[18]。但也有研究发现在急性LPS和亚慢性烟雾暴露后引起的小鼠气道炎症中，NF-κB：DNA组合的表达在3和14 d时并不增高；在慢阻肺患者NF-κB：DNA组合也没有增高，推断NF-κB信号途径并不是烟雾暴露引起的气道炎症中主要的核心途径[19]。这种结果可能和烟雾暴露的方法，浓度及检测的时间不同，患者的病情及是否仍在抽烟有关。此外，NF-κB做为信号传导通路的交汇点，在起始阶段不需要新的蛋白表达即可发挥激活其他转录因子的作用，而在疾病的发展过程中的表达可能会由于干预有所改变，如胆红素的干预抑制其表达。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38是MAPK家族中的成员之一，参与细胞的生长、增殖、分化、死亡及细胞间的功能同步等多种生理过程。目前认为p38与炎症细胞因子的调控密切相关。未活化的p38在体内的表达没有差异，但其受到体内外刺激如氧化应激和炎症刺激时可以被激活即磷酸化为p-p38[9,20,21]。p38一旦被激活后，可以活化一些转录因子，从而调节目的基因的表达，参与机体的应激反应[20,21]。
胆红素是血红素代谢后的一种下游产物，是一种内源性的强抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、促进机体免疫应答能力以及增强维生素C和E的抗氧化能力等多种功能。既往研究已经发现胆红素干预可以抑制肺部炎症和氧化应激反应，对肺组织表现出保护作用[21]。本研究通过建立烟草烟雾暴露的肺气肿模型并通过各种指标检验模型建立成功后，使用免疫组化和Western blot方法测定NF-κBp65、p38和p-p38的表达，探讨在炎症和氧化应激情况下，胆红素干预是否通过影响这些转录因子的表达从而发挥抗炎抗氧化作用。
免疫组化和Western blot结果中，p38在各组表达无明显差异，而各组p-p38表达较对照组高，说明炎症和氧化应激激活了p38。研究发现在慢阻肺患者痰中p-p38和IL-8的表达增高，且p-p38与IL-8的水平、中性粒细胞的浸润和患者的FEV1有关，提示p-p38在慢阻肺患者的气道炎症中起着重要的作用并可能成为慢阻肺未来治疗的靶点[21,22]。在动物模型中发现使用p38激动剂可以加速慢阻肺的发生发展[23]；而使用p38抑制剂可以抑制慢阻肺患者痰和血中中性粒细胞、CD8细胞和气道上皮细胞p38的激活及炎症因子IL-8和TNF-α的分泌，抑制脂多糖和刀豆蛋白酶(PHA)诱导的细胞和动物模型中炎症因子TNF-α、IL-1和IL-6的分泌[24,25,26]。这与我们结果中烟雾暴露组p-p38表达增高一致。在对心脏移植后缺血再灌注损伤的研究中发现移植物在再灌注前用胆红素溶液冲洗可导致较低的左心室舒张末期压力，改善左心室形成压，每压力产生心率和冠脉血流等，抑制再灌注后心肌细胞的凋亡，改善心脏评分，这些与胆红素处理抑制了p38MAPK有关[27]。本研究结果也显示胆红素可抑制p-p38的表达。
上述结果提示抗氧化剂胆红素可能发挥类似信号途径抑制剂的作用，可能通过抑制了p38MAPK和NF-κB的激活发挥细胞保护作用[19,27]。但也有研究发现未结合胆红素的预处理加重了全身放射性损伤，导致免疫细胞的功能缺失和免疫抑制，使得感染和死亡增加，提示胆红素处理导致的高胆红素血症可能存在潜在的危险[28]。研究发现，当未结合胆红素的临床相关浓度≥25 μmol/L时，对脾脏T细胞、B细胞、巨噬细胞、人外周血单个核细胞、红细胞等都有毒性，可以诱导脾脏萎缩、骨髓细胞枯竭、白细胞减少、淋巴细胞减少、T细胞和B细胞对有丝分裂原的反应降低等，可见体内胆红素浓度的异常升高对机体有免疫抑制的作用；而胆红素浓度的适当升高可以抑制LPS诱导的B细胞增殖和脾脏巨噬细胞细胞因子的产生[29]。可见胆红素浓度的高低是其发挥细胞保护作用还是免疫抑制作用的关键，胆红素在机体正常生理水平范围内的适当提高有助于其发挥保护作用[30,31]。
从以上结果可以推断，在长期熏烟的过程中，炎症刺激和氧化应激激活了转录因子NF-κBp65和MAPKp38，使得烟雾暴露组p65和p-p38表达较对照组增高，而后NF-κB和MAPKp38作为细胞信号传递系统的交汇点，又启动促炎因子、趋化因子等的转录，扩大了炎症反应及其损伤。而胆红素的干预抑制了NF-κBp65和MAPKp38的激活和表达，从而发挥其抗炎抗氧化的作用。