低氧诱导大鼠肺动脉重塑对肺动脉平滑肌锌指蛋白转录因子5表达的影响

肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是指肺动脉压力超过一定界值而出现的一种血流动力学异常状态。这种异常可导致右心负荷增大和右心功能不全，从而引起一系列临床表现。既往研究结果表明其主要病理特征为肺动脉收缩增强和出现以肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs)肥大和增殖为主要表现的肺血管重塑^[1]。而肺血管重塑是导致低氧性肺动脉高压(chronic hypoxia pulmonary hypertension, CHPH)发生持续不可逆性病理改变的重要因素。锌指蛋白转录因子5(Krüppel－like zinc－finger transcription factor 5, KLF5)属于SP/KLF因子家族，具有介入细胞增殖，细胞凋亡，分化等重要的生物学功能。文献报道KLF5参与动脉粥样硬化等心血管疾病血管重塑的过程^[2,3]。此外，KLF5在野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高压动物模型中起到重要的作用^[4,5]。然而KLF5是否通过调节低氧介导的肺动脉重塑，从而参与低氧性肺动脉高压疾病的发生发展仍有待探讨。本研究以CHPH大鼠模型为研究对象，观察肺中小动脉的病理变化，并探讨其是否与KLF5表达变化有关。

材料与方法

1．主要试剂和仪器：

SPF级Sprague－Dawley雄性大鼠：体重200～250 g，购于广东省实验动物中心[许可证号：SCXX(粤)2008－0002]；KLF5多克隆鼠抗抗体购于美国Abcam公司；β－肌动蛋白单克隆鼠抗抗体购于美国Santa cruz公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购于美国KPL公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris碱、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、聚偏二氟乙烯膜、ECL化学发光液、蛋白电泳转移系统均为美国Bio－rad产品；RIPA细胞裂解液购于中国碧云天生物技术公司；其余试剂均为国产分析纯产品，购于广州化学试剂厂。16通道小动物生理仪为美国BIOPAC公司产品，DG5033A型TECAN酶标仪购于南京华东电子集团医疗装备有限责任公司。

2．建模及分组：

按照文献[6]方法建立肺动脉高压大鼠模型，SD大鼠20只按随机数字表法分为常氧对照组、低氧组，每组10只。低氧组大鼠置于全自动常压低氧箱中，利用箱内置氧浓度仪检测箱内氧气浓度，并通过电磁阀和减压阀实时调节箱内气体，使氧气浓度维持在(10.0±0.5)%，连续21 d。常氧组大鼠置于常温常压SPF级环境饲养。显微镜下分离大鼠(6只)远端肺动脉平滑肌组织，胶原酶消化法培养大鼠原代肺动脉平滑肌细胞，用DMEM低糖培养基培养至50%～60%融合度后，将PASMCs分别置于低氧(4% O₂)和常氧(21% O₂)培养箱培养60 h，提取细胞蛋白及RNA分别通过Western blot和Q－PCR检测KLF5。

3．血流动力学指标测定：

21 d造模结束后，称量大鼠体重并予3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠固定于小动物手术台，打开腹腔，暴露膈肌，用2 mm口径的针头(已肝素化处理)通过膈膜插入右心室，连通压力换能器，用小动物生理仪测量右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)、平均右心室压(mean right ventricular pressure，mRVP)^[7,8]。开胸取心脏组织，剪去左右心房及心耳，从肺动脉出口处开始剪下右心室游离壁组织(right ventricle，RV)，其余为左心室＋室间隔组织(LV＋S)，剖开左心室，清洗并吸去多余水分后分别称重，计算右心肥厚指数RV/(LV＋S)。

4．KLF5蛋白检测：

参照文献[9]方法，使用Western－blot进行检测，分离大鼠左肺远端肺动脉，加入RIPA裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度。各组蛋白按40 μg上样，用10% SDS－PAGE电泳分离蛋白，浓缩胶100 V，20 min，分离胶120 V，60 min；100 V湿转法冰上转膜3 h，5% milk－TBST封闭1 h，一抗(1∶1 000)孵育过夜，第2天用含0.1%吐温20的TBST洗膜3～5次后孵二抗(1∶3 000)，常温摇床孵育20 min后再用含0.1%吐温20的TBST洗膜3～5次，用ECL显色液进行显色。使用β－肌动蛋白作为内参照物。

5．肺组织病理学观察和血管厚度的测定：

大鼠麻醉处死后分离气管，结扎左肺叶，4%多聚甲醛灌注固定右肺，石蜡包埋，常规病理学切片，HE染色，显微镜下观察。在IPPs 6.0图像处理系统中，用光标勾画出血管腔、外弹性膜以及血管轮廓，测量外直径51～200 μm的动脉血管管腔横截面积，计算肺小动脉中膜厚度(WT)和血管的外径(ED)，根据公式计算中膜厚度百分比：WT%＝(2×WT/ED)×100%^[10]。

6．免疫荧光法测定KLF5的表达：

根据文献[11]的方法，使用免疫荧光技术检测肺组织中KLF5的表达。3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，0.3%正常胎牛血清孵育，滴加一抗(1∶100)，4 ℃冷库孵育过夜，PBS缓冲液(Na₂HPO₄ 8.1 mmol/L，KH₂PO₄ 1.5 mmol/L，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L, pH值为7.4)振荡清洗后滴加二抗，抗荧光淬灭封片液封片。

7．统计学处理：

使用image J软件分析X线胶片灰度值，实验数据以均数±标准误表示，用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。两个样本均数比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

1．肺血流动力学改变：

低氧暴露21 d后，低氧组大鼠RVSP和mRVP分别为(43.9±1.3)和(26.5±2.3)mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，常氧组二者分别为(28.3±0.4)和(11.3±1.0)mmHg，两组相比，低氧组RVSP和mRVP均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与常氧组的RV/(LV＋S)(0.27±0.01)相比较，低氧组大鼠RV/(LV＋S)明显增高至(0.48±0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2．病理学改变：

常氧组和低氧组肺动脉结构改变如图1，图2。其中常氧组远端小肺动脉内膜完整平滑，平滑肌层无增厚，细胞排列规则、胞核大小一致，无炎症细胞浸润；而低氧组肺小动脉管壁及平滑肌层明显增厚，管腔狭窄，血管周围可见大量的淋巴细胞及中性粒细胞，细胞及胞核排列紊乱。与常氧组(68.7±3.1)%比较，低氧组血管腔占血管区域的比值明显下降，为(46.1±6.6)%，P<0.05；而血管中膜厚度百分比(WT%)由(3.7±0.4)%增加至(5.6±0.3)%，差异有统计学意义(P<0.01)，慢性低氧诱导大鼠肺小动脉发生了明显的血管重塑。

图1，2

光镜下大鼠肺组织病理，常氧组和低氧组远端肺小动脉血管结构改变(箭头所示)，图1和图2分别为常氧组和低氧组的远端肺小动脉。常氧组(图1)可以看到远端小肺动脉内膜完整平滑，平滑肌层细胞排列规则、胞核大小一致、排列规则，无炎症细胞浸润，全层无增厚；低氧组(图2)肺组织炎症细胞浸润明显，血管周围可见大量的淋巴细胞及中性粒细胞，肺动脉平滑肌细胞及胞核排列紊乱，全层增厚；箭头所示为远端肺小动脉　HE染色　低倍放大

图1，2

3．免疫荧光技术：

激光共聚焦扫描结果显示：肺血管平滑肌细胞核在镜下呈绿色荧光，KLF5蛋白在镜下呈红色荧光。阴性对照组肺组织仅检测到绿色荧光(图3)；低氧组红色荧光较正常对照组更加明显，表明低氧组肺组织中KLF5表达增高(图3, 图4, 图5, 图6)。

图3～6

免疫荧光技术检测KLF5在低氧和常氧肺组织中的表达：图3，5　分别为常氧组和低氧组，YO－PRO－1核染色；图4，6　分别为常氧组和低氧组，KLF5蛋白的免疫荧光染色。激光共聚焦扫描结果显示正常对照组和低氧组均可见到KLF5的表达，低氧组KLF5表达明显升高

图3～6

4．肺动脉平滑肌KLF5 mRNA的表达：

Q－PCR结果表明低氧培养的大鼠肺动脉平滑肌组织中KLF5 mRNA为常氧培养组的相对表达量的(3.68±0.24)倍(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。

5．肺动脉平滑肌KLF5蛋白表达：

Western blot结果表明(图7，图8)低氧性肺动脉高压大鼠模型肺动脉平滑肌组织中KLF5蛋白的表达量为常氧对照组的(21.64±7.18)倍，差异有显著统计学意义(P<0.05)。此外，体外实验结果也显示，低氧可诱导PASMCs中KLF5蛋白明显升高，为常氧组的(1.73±0.26)倍(P<0.05)。

图7

大鼠肺动脉平滑肌KLF5蛋白免疫印迹结果

图7

大鼠肺动脉平滑肌KLF5蛋白免疫印迹结果

图8

体外常氧和低氧培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞KLF5蛋白免疫印迹结果

图8

体外常氧和低氧培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞KLF5蛋白免疫印迹结果

讨论

肺动脉高压的发病机制主要包括血管的收缩障碍、血管重塑和原位血栓形成。其中肺动脉平滑肌细胞异常增殖是导致的肺血管重塑的关键环节，然而肺血管重塑具体的机制仍不十分明确，有待进一步研究。锌指蛋白转录因子5又称Krüppel样因子5，属于SP/KLF因子家族，具有重要的生物学功能，能够介导细胞增殖、凋亡和分化等功能活动^[12,13,14]。大量研究结果表明，KLF5可以通过促进血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子－α抑制蛋白2(TNFAIP2)等生长因子的表达导致肿瘤的增殖、迁移和转移^[13,15,16]。KLF5还可以通过活化早期生长反应蛋白－1(Egr－1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、VEGF等细胞因子参与动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展^[2]。近年来KLF5在肺动脉高压发病中的作用受到广泛重视。Courboulin等^[4]发现KLF5在肺动脉高压患者的肺组织和末梢肺动脉平滑肌细胞中的表达量增加，同时，KLF5上升的水平与肺动脉高压的严重程度有关。而KLF5蛋白表达减少可降低肺动脉高压MCT模型大鼠的PASMCs增殖作用；相比野生型小鼠，KLF5基因敲除小鼠的右心室压及肺动脉压明显降低^[4]。但KLF5在低氧介导的肺血管重塑中的作用及其分子机制并不明确。

急性低氧可导致肺动脉收缩，慢性低氧可导致肺动脉重塑^[11,12]，是CHPH发生发展的重要因素。本研究结果显示，低氧21 d后大鼠RVSP、mRVP和右心肥厚指数与常氧组相比，均明显上升。肺组织病理结果显示，低氧组远端肺动脉血管管腔占血管区域比显著降低，而血管中膜厚度百分比显著升高，表明在慢性低氧条件下远端肺动脉发生了重塑，上述结果均表明低氧性肺动脉高压造模成功。免疫荧光可见，低氧组在肺内的KLF5蛋白表达量增加。除此之外，体内外实验结果显示，低氧可诱导PASMCs中KLF5表达上升。因此在CHPH模型中，大鼠远端肺动脉发生了以PASMCs增殖为特征的血管重塑并伴有肺动脉平滑肌组织KLF5表达上升。Li等发现KLF5可通过增加cyclinB1促进PASMCs的增殖^[4,17]。同时，KLF5还可以通过增加survivin蛋白引起线粒体膜去极化，阻止促凋亡因子的释放，从而抑制PASMCs凋亡^[5,18,19]。另外，KLF5可以通过Bad磷酸化通路阻滞caspase－3的表达，进而促进肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移^[12,20]。由此，我们推测在CHPH大鼠模型中，KLF5表达升高可能参与了PASMCs增殖的过程。

低氧诱导因子－1(hypoxia－inducible factor 1，HIF－1)是肺动脉高压的发生发展的重要作用因子^[21]，HIF－1α在低氧诱导PASMCs的增殖过程中起到了非常重要的作用^[22,23]，甚至认为HIF－1α可通过调控KLF5来调节细胞功能。在胰腺癌的研究中发现，阻滞HIF－1α可以减少KLF5的表达，且HIF－1α的增加伴随着KLF5表达的增加；同时，阻断KLF5也可以降低由HIF－1α调控的基因，如GLUT－1等的表达^[24]。然而一项关于结肠癌的研究表明，在磷脂酶A对HIF－1α的调控中，KLF5对HIF－1α的启动子有抢占作用，可以作为HIF－1α的上游调节因子^[25]。前期研究结果发现HIF－1α可促进PASMCs钙离子内流，从而导致肺血管平滑肌的增殖，并最终导致肺血管重塑^[26,27]。因此，我们推测在低氧性肺动脉高压的发生过程中，HIF－1α可能参与了对KLF5的调控，从而促进PASMCs的增殖和肺血管重塑。但是，HIF－1α与KLF5的相互关系仍有待进一步研究探讨，从而揭示KLF5在低氧介导的肺血管重塑中的分子机制。