大气颗粒物(airborne particulate matter，APM)是指空气中的固体、液体气溶胶或固-液颗粒混合物，其中空气动力学直径在2.5 μm以下的细微颗粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)对人体呼吸、心血管系统等产生不可忽视的影响[1]。在我国，影响城市和农村人群的PM2.5主要来源并不一致，机动车辆产生的PM2.5被认为是城市大气中PM2.5的主要来源，烹饪和取暖需要所采用的生物燃料(如木材、秸秆和动物粪便等)是农村室内空气中PM2.5的主要来源。PM2.5在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)发病中的可能作用受到广泛关注[2]。研究结果显示慢阻肺患者的气道中存在上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)现象[3,4]，EMT被认为是导致慢阻肺患者气道重塑的重要机制之一[5]。本研究观察了交通主干道旁大气PM2.5(arterial traffic ambient PM2.5，TAPM2.5)和生物燃料(木材烟雾)来源的PM2.5(wood smoke PM2.5，WSPM2.5)对人气道上皮细胞(HBEC)转分化的影响，探讨PM2.5在慢阻肺发病中的可能作用及其机制。
大流量采样器装配PM2.5切割头(美国Tisch TE-6070)，洁净玻璃纤维滤膜(20.3 cm×25.4 cm，英国Whatman公司)，Axio. Imager. Z2显微扫描分析系统(德国卡尔蔡司公司)，荧光倒置相差显微镜(德国莱卡公司)，垂直电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)，HBEC(广州医科大学实验中心)，DMEM高糖培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，美国Sigma公司)，人重组TGF-β1因子(美国R&D公司)，兔抗人Ⅰ型胶原蛋白(collagen type-Ⅰ，美国Abconal公司)，兔抗人E-钙黏素蛋白(E-cadherin)、小鼠抗人泛-细胞角蛋白(pan-Cytokeratin)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)和小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA，美国Abcam公司)，GAPDH、山羊抗兔HRP标记IgG二抗和山羊抗小鼠HRP标记IgG二抗(中国赛诺博生物公司)，DyLight 488山羊抗兔IgG荧光二抗和DyLight 594山羊抗小鼠IgG荧光二抗(美国Jackson公司)，化学发光液(美国ThermoFisher公司)，细胞毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所)。
(1)采集：TAPM2.5采集自广东省广州市东风西路繁忙道路旁2015年3—4月期间交通繁忙时段(8∶00—21∶00)，每张滤膜采样约13 h，采样器放置距道路边缘3 m，距地面2 m。WSPM2.5采集自南方农村厨房，燃烧木材为杉木，杉木充分燃烧时开始采样，每张滤膜采样时间约1 h，采样器放置距离炉灶2 m。2种PM2.5均使用装配PM2.5切割头的大流量采样器，富集滤膜为洁净玻璃纤维滤膜，采样流量为1.13 m3/min。(2)制备：采集有TAPM2.5和WSPM2.5的滤膜，根据滤膜上PM2.5净重分别浸入相应体积DMSO溶液中，水浴中超声波振荡仪振荡30 min(保持水温不超过30 ℃)，充分溶解后高速离心12 000 g×15 min，弃沉淀，重复步骤3次，充分去除不溶颗粒物，回收溶液。按滤膜萃取前实际装载的PM2.5净重对两种DMSO萃取液中PM2.5浓度按以下公式进行换算：PM2.5-DMSO浓度 ＝∑PM2.5净重/DMSO体积。
换算后TAPM2.5-DMSO浓度为15 mg/ml，WSPM2.5-DMSO浓度为40 mg/ml。临用时用培养基稀释至所需浓度，稀释后各剂量组DMSO终浓度均不超过0.5%(体积比)。同样方法制备空白玻璃纤维滤膜的DMSO萃取物(Blank-DMSO)，作为实验正常对照组。
正常人支气管上皮细胞由广州医科大学实验医学研究中心赠送。用含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞密度达80%～90%时消化传代。按10 000/cm2接种，培养24 h后细胞密度在60%～70%时用于后续实验。
于实验前以含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培养液配置TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO至所需浓度。正常对照组为含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培养液稀释Blank-DMSO至终浓度为0.1%(或刺激组最高浓度组所对应DMSO浓度)，阳性对照组为同样培养液配置的10 ng/ml TGF-β1。
细胞增殖-毒性试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)加入水溶性四唑盐[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，WST-8]，经细胞内脱氢酶氧化还原生成橙黄色甲臜，可溶解在组织培养基中，甲臜生成量与活细胞数量成正比，检测吸光度值可反映细胞活力。HBEC接种于96孔板置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，更换无胎牛血清DMEM高糖培养液同步化细胞24 h，然后分别加入不同浓度PM2.5-DMSO萃取物，每个浓度均设6个复孔。TAPM2.5-DMSO浓度分别为：0.2、1、2、10、20、100、200 μg/ml，WSPM2.5-DMSO浓度分别为：1、5、10、15、20、30、40 μg/ml。培养24 h后加入CCK-8试剂，37 ℃、5% CO2培养箱孵育2 h后通过酶标仪检测490 nm波长吸光度值(A)：
HBEC接种于直径15 mm玻璃爬片，刺激14 d后取出，加入－20 ℃预冷甲醇1∶1丙酮混合液(体积比)，室温固定20 min；加入0.5%Triton X-100，室温放置10 min；5%BSA于37 ℃封闭30 min；分别滴加兔抗人E-钙黏素蛋白抗体(1∶200)、小鼠抗人α-SMA抗体(1∶100)、兔抗人波形蛋白或小鼠抗人泛-细胞角蛋白于4 ℃孵育过夜；DyLight 488抗兔IgG荧光二抗(绿色)工作液(1∶200)和DyLight 594抗小鼠IgG荧光二抗(红色)工作液(1∶200)，在室温、避光条件下孵育1 h；加稀释核染色液DAPI(2 mg/ml)，室温、避光孵育5 min；将玻璃爬片以细胞面朝下固定于已滴加甘油的干净普通载玻片上，胶水固定后于Axio. Imager. Z2显微扫描分析系统中观察细胞荧光表达情况。
独立重复实验次数≥3次，数值结果用平均值±标准差表示。使用SPSS 17.0对数据进行统计分析。多组间比较用单因素方差分析，P<0.05则认为差异有统计学意义。半数抑制浓度(inhibitory concentration 50，IC50)使用GraphPad Prism 5软件统计分析，以95%可信区间表示。
于交通主干道旁共采集到27个大气PM2.5样本，平均大气PM2.5浓度为(79.94±23.89)μg/m3，于农村厨房内共采集到49个木材烟雾PM2.5样本，平均大气PM2.5浓度为(4 004±2 054)μg/m3。
TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO分别刺激HBEC 24 h后用CCK-8法检测细胞活力。TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO均于较低浓度组(1、2、10 μg/ml和1、5、10 μg/ml)增强细胞活力[分别为(118.4±13.7)%、(118.2±8.0)%、(123.0±19.6)%和(112.4±4.1)%、(120±5.4)%、(117.8±7.0)%，F值分别为71.4和49.093，均P<0.05]，在TAPM2.5-DMSO(20 μg/ml)和WSPM2.5-DMSO(15和20 μg/ml)刺激组细胞活力处于平衡状态[(100.7±12.1)%和(106.8±10.0)%、(93.8±7.9)%，P值分别为0.923、0.231和0.278]，在较高浓度组随刺激浓度增加(100、200 μg/ml和30、40 μg/ml)细胞活力逐渐下降[(53.4±15.3)%、(9.4±1.7)%和(60.9±9.5)%、(46.2±3.6)%, 均P<0.01]。IC50分别为104.1(88.22～122.9)μg/ml和34.91(31.14～39.15)μg/ml。
TAPM2.5-DMSO(20 μg/ml)、WSPM2.5-DMSO(10 μg/ml)和TGF-β1(10 ng/ml)刺激HBEC 14 d后，细胞形态均出现不同程度改变，主要呈长梭形或不规则形，细胞间连接减少(图1, 图2, 图3, 图4)。
TAPM2.5-DMSO(20 μg/ml)、WSPM2.5-DMSO(10 μg/ml )和TGF-β1(10 ng/ml)刺激HBEC 14 d后，荧光显微镜高倍镜下可观察到刺激组HBEC细胞间连接明显减少，细胞间上皮细胞标志物E-cadherin表达均较对照组减少，部分细胞表达间充质细胞标志物α-SMA或波形蛋白，有的细胞同时表达E-cadherin和α-SMA或波形蛋白(图5, 图6, 图7, 图8, 图9, 图10, 图11, 图12, 图13, 图14, 图15, 图16, 图17, 图18, 图19, 图20, 图21, 图22, 图23, 图24, 图25, 图26, 图27, 图28)。
 | 表1 蛋白免疫印迹检测EMT相关标志物刺激组与正常对照组比值( |
蛋白免疫印迹检测EMT相关标志物刺激组与正常对照组比值(
±s)
| 组别 | 孔数 | E-钙黏素蛋白 | 细胞角蛋白 | COL-Ⅰ | α-SMA |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| TAPM2.5-DMSO | 4 | 0.862±0.096 | 0.063±0.109a | 2.549±1.037a | 5.906±2.727 |
| WSPM2.5-DMSO | 4 | 0.817±0.212 | 0.039±0.313a | 3.658±1.207a | 7.853±4.784a |
| TGF-β1 | 4 | 0.693±0.199a | 0.043±0.025a | 2.965±0.667a | 15.803±6.910a |
| F值 | 0.236 | 21.037 | 6.821 | 7.773 | |
| P值 | 0.869 | 0.000 | 0.006 | 0.004 |
注：COL-Ⅰ：Ⅰ型胶原蛋白；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；a刺激组与对照组比较P<0.05
TAPM2.5-DMSO(20 μg/ml)、WSPM2.5-DMSO(10 μg/ml )和TGF-β1(10 ng/ml)刺激HBEC 14 d后，与对照组比较，TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO刺激组的上皮细胞标志物Cytokeratin表达明显下降，差异有统计学意义(0.063±0.109和0.039±0.313，F＝21.037，均P<0.001)；上皮细胞标志物E-cadherin在TGF-β1刺激组表达下降，差异有统计学意义(0.693±0.199，P<0.05)，在TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO刺激组表达减少，但差异无统计学意义(0.862±0.096和0.817±0.212，P值分别为0.228和0.117)；WSPM2.5-DMSO和TGF-β1刺激组细胞的间充质细胞标志物α-SMA表达上调(7.9±4.8和15.8±6.9，F＝7.773，均P值分别为0.049和0.000)，TAPM2.5-DMSO刺激组α-SMA升高，但与对照组差异无统计学意义(5.9±2.7，P>0.05)；间充质细胞标志物COL-Ⅰ在刺激组均较对照组表达上调(2.55±1.04、3.66±1.21和2.96±0.67，F＝6.821，均P<0.05)，差异有统计学意义。
慢阻肺患者存在不可逆的气流受限，其中的重要病因是吸入有毒颗粒或气体后诱导机体出现炎症反应，肺组织反复损伤-修复，腺体增生、小气道结构重塑[5,6]，而EMT是引起气道重塑的重要机制[7]。EMT是指上皮细胞获得间充质细胞表型所经历的生物学过程[8]，上皮细胞失去原有的上皮细胞特性，获得迁移性、侵袭性、抗凋亡能力以及产生细胞外基质的能力等间充质细胞特性[9]，气道上皮细胞EMT与肿瘤发生、组织纤维化和慢阻肺气道重塑等密切相关[3,9,10]。
本课题组前期动物实验发现木材烟雾(杉木)空气污染慢阻肺模型大鼠气道中存在EMT改变[11]，体外实验结果表明木材烟雾(杉木)的凝集物可诱使人气道上皮细胞发生EMT样变化[12]。有文献报道人工合成富含稳定自由基的PM刺激人气道上皮细胞时，被刺激的细胞出现了EMT改变[13]。Milara等[3]在慢阻肺患者气道里亦观察到EMT现象的发生。这些前期的研究结果提示，空气中的颗粒物可能参与气道上皮细胞EMT的发生。
肺组织受有毒物质刺激反复损伤-修复导致气道重塑，这过程由多种组织细胞共同参与，包括纤维细胞和肌纤维细胞增加，上皮细胞纤毛丢失，杯状细胞增多增大，黏膜下腺和平滑肌细胞增生肥大等[5,14]。而支气管上皮细胞发生EMT被认为是慢性气道重塑中纤维细胞和肌纤维细胞一个重要来源[5,15]。本研究中使用的正常人支气管上皮细胞株在本课题组既往研究中证明具有典型支气管上皮细胞特征[11,12]，通过细胞形态、E-cadherin、pan-Cytokeratin、α-SMA及波形蛋白对HBEC进行细胞免疫荧光双染检测，证实所用细胞为正常人支气管上皮细胞。观察到两种来源PM2.5均在较低浓度范围刺激正常人支气管上皮细胞时细胞活力升高，随即在较高浓度时抑制细胞活力，呈双相变化。基于此结果，我们选取多个剂量(TAPM2.5-DMSO为2、10、20、40 μg/ml，WSPM2.5-DMSO为5、10、15、20 μg/ml)刺激细胞，发现2种PM2.5均在较低浓度范围时促进细胞生长导致早期便出现细胞接触抑制；在受到较高浓度刺激时，细胞经长时间培养后逐渐死亡，而在TAPM2.5-DMSO(20 μg/ml)和WSPM2.5-DMSO(10 μg/ml)浓度下可诱导细胞出现EMT改变，提示2种PM2.5引起的细胞活力水平变化有一些差异，但均可诱导EMT，且发生在较窄的浓度范围内。根据Gualtieri等[16]和Mercer等[17]对支气管表面积和PM2.5沉积量的估算方法，上述PM2.5干预浓度分别相当于交通路旁大气约20 d(假设每天暴露6 h)和农村厨房木材烟雾约1.2 h的暴露量，可见实际生活PM2.5暴露量可以达到实验刺激浓度所对应的大气PM2.5暴露量，同时可计算诱导出现EMT的交通相关PM2.5暴露量约为木材烟雾PM2.5的2倍，木材烟雾来源的PM2.5可能比交通主干道旁来源的PM2.5具有更强的诱导支气管上皮细胞发生EMT的能力。
本研究中所用采样器配备PM2.5切割头可以收集到大气中超过90%粒径<2.5 μm的粒子[18]，其滤膜上富集的粒子常用于研究PM2.5的实验[19,20]，2种来源PM2.5样品性质应与真实环境的PM2.5相关。据报道，木材烟雾PM2.5含有较多的多环芳烃等有机物，而交通路边PM2.5含有更多的重金属等[21,22]，据此推测刺激浓度差异可能与2种来源PM2.5主要化学成分不同有关。
本研究结果表明，2种PM2.5和TGF-β1刺激后人支气管上皮细胞形态从典型的铺路石样变为长梭形或不规则形态，3种刺激下细胞形态变化相似；细胞免疫荧光结果显示细胞膜上的上皮细胞特征标志物E-cadherin表达减少，细胞分布松散，细胞连接消失，同时部分细胞表达间充质细胞标志物α-SMA和波形蛋白，部分细胞同时表达E-cadherin和α-SMA或波形蛋白，提示这些细胞发生EMT或处于过渡状态[13]。本研究中TGF-β1诱导人支气管上皮细胞出现的EMT改变与文献报道一致[23,24]。蛋白免疫印迹实验结果显示，与对照组相比，交通主干道旁大气PM2.5和木材烟雾PM2.5均出现上皮细胞标志物骨架蛋白Cytokeratin表达下调。木材烟雾PM2.5刺激后上皮细胞出现表达于肌成纤维细胞的特殊标志物α-SMA，而交通主干道旁大气PM2.5组α-SMA的表达上调并无统计学意义，2种来源PM2.5在诱导α-SMA的表达水平上略有差异；细胞外基质COL-Ⅰ则在2种PM2.5刺激后都出现表达上调，且在木材烟雾PM2.5组升高的幅度较交通主干道旁大气PM2.5高，提示两种PM2.5诱导HBEC发生的EMT可能有所区别。跨细胞膜的E-cadherin通过与F-actin和α-actin等结合从而在细胞间连接和维持细胞极性上起重要作用，当E-cadherin表达减少或者从细胞膜分离，可导致细胞间连接减少[25]，交通主干道旁大气PM2.5和木材烟雾PM2.5并不能引起E-cadherin在总蛋白水平的降低，与免疫荧光定位于膜上的E-cadherin表达减少不一致，推测E-cadherin可能只是从膜上向膜内移位[26,27]，与TGF-β1组变化情况不一致，提示这2种来源PM2.5引起EMT的机制与TGF-β1不尽相同，需进一步实验证实。
综上所述，交通主干道旁大气PM2.5和木材烟雾PM2.5均可引起人支气管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化改变，木材烟雾PM2.5引起的特定间充质标志物改变与交通道路大气PM2.5不尽相同，木材烟雾PM2.5可诱导人支气管上皮细胞表达α-SMA和更显著的COL-Ⅰ表达，其诱导EMT作用似乎更显著。
初步观察交通主干道旁大气细微颗粒物(TAPM2.5)和使用木材烹饪厨房内细微颗粒物(WSPM2.5)对人支气管上皮细胞(HBEC)上皮-间充质细胞转分化(EMT)的影响。
分别采集交通主干道旁和使用木材烹饪的厨房内大气中的细颗粒物，通过DMSO萃取获得TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO。用不同浓度TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO刺激HBEC 24 h后，应用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活力；通过细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法，检测TAPM2.5-DMSO(20 mg/L)、WSPM2.5-DMSO(10 mg/L)刺激HBEC 14 d后，上皮细胞标志物E-钙黏素蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)和间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白和Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的表达情况。
TAPM2.5-DMSO(浓度为1、2、10 mg/L)和WSPM2.5-DMSO(浓度为1、5、10 mg/L)对细胞活力产生影响，增强细胞的活力[分别为(118.4±13.7)%、(118.2±8.0)%、(123.0±19.6)%和(112.4±4.1)%、(120±5.4)%、(117.8±7.0)%, F值分别为71.4和49.09，均P<0.05]，在TAPM2.5-DMSO(20 mg/L)和WSPM2.5-DMSO(15和20 mg/L)刺激组细胞活力处于平衡状态[(100.7±12.1)%和(106.8±10.0)%、(93.8±7.9)%，均P>0.05]。TAPM2.5-DMSO浓度达到100、200 mg/L，WSPM2.5-DMSO浓度达到30、40 mg/L后，对细胞活力逐渐呈现抑制作用[分别为(53.4±15.3)%、(9.4±1.7)%和(60.9 ±9.5)%、(46.2±3.6)%, 均P<0.01]。与空白对照组相比，TAPM2.5-DMSO和WSPM2.5-DMSO刺激组细胞形态发生改变，细胞免疫荧光提示上皮细胞标志物E-cadherin和Cytokeratin表达减少，间质细胞标志物α-SMA和波形蛋白表达上调；蛋白免疫印迹提示Cytokeratin表达水平在两组均明显下调[(0.063±0.109)和(0.039±0.313)，P值分别为0.033和0.030]，E-cadherin表达呈下调趋势，但差异无统计学意义[(0.862±0.096)和(0.817±0.212)，P值分别为0.228和0.117]；PM2.5刺激组COL-Ⅰ表达均上调[(2.549±1.037)和(3.658±1.207)，P值分别为0.034和0.001]，α-SMA仅在WSPM2.5-DMSO刺激组表达明显上调(8±5，P＝0.049)。
交通主干道旁大气PM2.5和木材烟雾PM2.5均可引起人支气管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化改变，木材烟雾PM2.5的作用似乎更为显著。