细胞骨架调控心肌蛋白相关转录因子－A对高氧诱导的肺成肌纤维细胞表型转化的影响
2016年10月
中华结核和呼吸杂志，第39卷第10期 第822页-第825页
朱晶|程燕雯|王迎难|吴巧玲|赵天明|倪吉祥
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吸氧是许多疾病如新生儿或成人呼吸窘迫综合征、循环休克、严重感染和多器官功能衰竭的重要治疗手段，然而长时间高浓度吸氧过程中可出现急性弥漫性肺泡损伤致炎性渗出，肺间质胶原沉积形成肺纤维化，缺乏有效的治疗方法并危及生命[1,2]。研究结果表明以表达α－SMA及collagen－Ⅰ为分子标记的肺成肌纤维细胞的活化在肺纤维化形成机制中扮演着重要角色[3]。因为该细胞过度增殖、凋亡减少及在纤维病灶和周围组织中分泌并合成大量细胞外基质，导致肺组织重塑、并最终导致肺内结构改变和功能丧失[4]。高氧可诱导肺成纤维细胞向具有收缩力的肺成肌纤维细胞表型转化和增加胶原的合成[5]。
肺成纤维细胞向成肺成肌纤维细胞转化的机制已有较多报道，骨骼肌机械应力产生的Rho信号激活子(START)和NADPH氧化酶4(NOX4)在电子传递过程中产生的活性氧通过RhoA及下游的Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号途径促进MRTF－A向胞核转位，进而促使血清反应因子(SRF)基因转录，表达α－SMA以及collagen－Ⅰ，来调控成肌纤维细胞表型转化[5,6,7,8,9,10]。在动物模型及人成纤维细胞中，RhoA的激活在高氧所诱导的肺纤维化中扮演了重要作用[5]。RhoA信号途径受许多调控因子调控。如许多酪氨酸激酶的调控，这些调控因子相互交叉形成复杂的调控网络[11]。文献报道使用酪氨酸激酶抑制剂及活性氧清除剂均可以阻断肺成纤维细胞向肺成肌纤维细胞转化，抑制α－SMA及collagen－Ⅰ的产生[12]。细胞骨架的动力结构主要为肌动蛋白。肌动蛋白包含单体肌动蛋白和可聚合成丝状的肌动蛋白两种形式[12,13,14]。这种解离及聚合过程影响着细胞骨架的稳定，除了受RhoA的调节，还受其他方面的调节，如高氧、酪氨酸激酶的调节[5,11]。细胞骨架可以通过与细胞黏附分子和受体形成复合体，参与跨膜信号的传递[15]，然而在高氧暴露诱导的肺纤维化形成中，细胞骨架肌动蛋白影响肺成肌纤维细胞表型的转化和促进胶原合成的机制目前仍尚不完全清楚。
本研究中尝试观察细胞骨架是否通过调节心肌蛋白相关转录因子－A(MRTF－A)从而促使肺成纤维细胞向肺成肌纤维细胞转化和胶原的合成，结果表明暴露在高氧的肺成纤维细胞，通过促使细胞骨架的解离和干扰MRTF－A的表达或向胞核转位，可以抑制α－SMA及collagen－Ⅰ蛋白表达的增加。
细胞培养和高氧暴露：HFL－1细胞在含10%小牛血清和抗生素(青霉素10 U/ml、链霉素100 μg/ml、庆大霉素20 μg/ml和两性霉素B 2 μg/ml)的F12K培养基中培养2～3 d，然后在温度为37 ℃、95% O2和5% CO2的环境下进行高氧暴露。正常对照组在21% O2和5% CO2的环境下暴露。
蛋白质提取和蛋白质印迹(Western blot法)：我们使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，离心后吸取上清。使用考马斯亮蓝R－250染色测定蛋白质浓度后，以每泳道蛋白质20 μg上样，常规电泳并转膜。5%的牛奶常温封闭1 h，然后分别用封闭液稀释的α－SMA (美国Santa Cruz公司)、collagen－Ⅰ(美国Novus公司)、内参照物GAPDH(美国Cell Signaling公司) Ⅰ抗在4 ℃下孵育过夜。以同样的方法准备Ⅱ抗稀释液并于膜接触，在37 ℃下孵育1 h。膜上的蛋白条带采用免疫化学发光法显影曝光；以Bio－Rad定量软件对蛋白表达的条带进行吸光度值定量分析，经内参GAPDH平衡后，以对照组的倍数作为该蛋白的相对表达量。
实时定量PCR：使用RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司，批号：80204)将肺成纤维细胞匀浆后提取总RNA，为检测α－SMA、COL1A1、COL1A2和MRTF－A的mRNA表达水平， 我们采用高保真的互补DNA反转录酶(Applied Biosystems，USA)进行反转录。Real－time PCR的完成按照TaqMan基因表达试剂盒(美国Applied公司，批号：402823)说明书进行操作，引物分别为Hs00426835_g1(α－SMA)、Hs00164004 _ m1(COL1A1)、 Hs00164004_m1(COL1A2)、Hs00252979_m1(MRTF－A)和Hs03003631_g1 (18 s rRNA)。PCR反应体系为50 ℃ 2 min, 95℃ 10 min；然后再95 ℃ 15 s 60 ℃ 1 min进行40个循环。PCR反应使用7900实时定量PCR仪(美国Applied公司)进行，重复3次。数据分析是通过与内参(18 s rRNA)对比后得出的相对的扩增循环次数来分析α－SMA、COL1A1、COL1A2、MRTF－A的mRNA表达水平(2－ΔΔCT 法进行相对定量分析)。
免疫共聚焦显微镜：采用4%多聚甲醛固定HFL－1细胞，给予Tritonx－100孵育10 min和5%山羊血清孵育30 min。使用Texas－red phalloidin和标记抗山羊IgG的鼠抗MRTF－A染色F－肌动蛋白和MRTF－A。对比染色试剂采用4′，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)，最后使用免疫共聚焦显微镜获得荧光图像。
G－肌动蛋白和F－肌动蛋白的检测：按照美国Cytoskeleton公司试剂盒(批号：BK037)说明书分离细胞裂解中的G－肌动蛋白和F－肌动蛋白片段，Western blot法检测含量。
MRTF－A基因沉默：按照siRNA试剂盒(MRTF－A批号：sc－43944，美国Santa Cruz生物科技公司)说明书将含有抗MRTF－A的siRNA转染到HFL－1细胞，使MRTF－A基因沉默。将无任何靶基因的siRNA(批号：AM4611，美国Applied公司)用于阴性对照。在含有4%胎牛血清的F12K培养基中，使用美国Qiagen公司的RNAifest转染试剂盒(批号：301525)，将1 μg siRNA MRTF－A或阴性对照siRNA转染到HFL－1细胞中，siRNA与转染试剂之比为1∶3。转染48 h后，将细胞进行高氧和正常氧暴露，然后再分析α－SMA、MRTF－A和collagen－Ⅰ蛋白及mRNA水平。
染色质免疫沉淀技术(ChIP)：ChIP分析根据ChIP试剂盒(美国Millipore公司，批号：17－1000)所提供的试剂和方法完成。首先使用1%甲醛与细胞交联10 min，再用PBS清洗细胞，然后把细胞刮下来用含有蛋白酶抑制剂的1%裂解缓冲液悬浮细胞。超声粉碎每个样本，13 000 r/min，离心10 min，离心半径为13.5 cm。将上清液移至新的离心管，再用超过10倍的ChIP稀释缓冲液进行稀释。按照30 μl/ml Salmon Sperm DNA/Protein A－agarose Slurry加入样本中去除非特异性，再加入8 μg/ml抗MRTF－A或抗核仁素C23抗体孵育1 h。加入30 μl/ml Salmon Sperm DNA/Protein A－agarose Slurry后，将所有样本在4 ℃下振荡过夜。加入1% SDS 0.1 mol/L NaHCO3 250 μl洗脱缓冲液分离出DNA蛋白复合物。再加入200 μmol/L NaCl在65 ℃下孵育4 h进行反转交联。将10 μmol/L EDTA、40 μmol/L Tris－HCl、20 μg蛋白酶K加入样本中并在45 ℃下孵育1 h。使用苯酚、异戊醇从样本中抽提并纯化DNA。使用Applied Biosystems的SYBR Green Master Mix进行实时PCR检测样本。PCR所需引物：α－SMA上游引物：5′－AGC AGAACAGAGGAATGCAGTGGAAGAGAC－3′和α－SMA下游引物5′－CCTCCCACT CGCCTCCCAAACAAGGAGC－3′。反应条件为：退火温度为61 ℃，延伸温度为72 ℃，共进行55个循环。该反应在Applied Biosystems7900实时PCR仪中完成。PCR所得到数据与抗核仁素C23进行对比后，采用2－ΔΔCt法来计算其相对表达量。
统计学方法：本研究中实验组和对照组的细胞系、密度及传代数目相匹配。数据结果计量资料采用均数±标准差表示，三组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。所有数据统计分析均可采用SPSS 17.0统计软件完成。
Jasp促进肺成肌纤维细胞的转化和增加胶原的合成：为了研究肌动蛋白细胞骨架在高氧诱导肺成肌纤维细胞的转化和胶原的合成的角色。HFL－1细胞在含有不同浓度的肌动蛋白稳定剂Jasp(50～200 nmol/L)条件下孵育24 h(图1, 图2, 图3, 图4)。在含有Jasp下孵育可以造成浓度依赖性增加微丝肌动蛋白的形成和提高F－肌动蛋白/G－肌动蛋白的比值，这说明了Jasp促进了单体的G－肌动蛋白向聚合的F－肌动蛋白的转变(图5)。而细胞骨架F－肌动蛋白聚合增加，同时也伴随了α－SMA、collagen－Ⅰ蛋白合成增加(图6)。这些结果均表明了Jasp促进肺成肌纤维细胞的转化和增加胶原的合成。
注：collagen－Ⅰ：Ⅰ型胶原蛋白；α－SMA：α－平滑肌动蛋白；GAPDH：内参照物
细胞松弛素D抑制高氧诱导的肺成肌纤维细胞的转化和胶原的合成：我们将HFL－1细胞在含或不含有细胞松弛素D(2 μmol/L)条件下孵育1 h，然后再暴露在正常氧和高氧(95% O2)下孵育24 h(图7, 图8, 图9, 图10)。经2 μmol/L的细胞松弛素D处理HFL－1细胞1 h后，可引起细胞骨架解离。并抑制了高氧诱导的α－SMA、collagen－Ⅰ蛋白和mRNA水平的高表达(图11)，这表明了细胞松弛素D可以抑制高氧诱导的肺成肌纤维细胞的转化和胶原的合成。
注：1：对照组；2：50 nmol/L；3：100 nmol/L；4：200 nmol/L；GAPDH：内参照物
肌动蛋白细胞骨架的聚合和解离对高氧诱导的成肌纤维细胞形成的调控：使用免疫共聚焦显微镜观察MRFT－A在胞质及胞核的浓度变化，将HFL－1细胞暴露在高氧状态下(95%O2)，发现相对于正常氧浓度，高氧组HFL－1细胞核内表达MRTF－A明显增强；这种高表达，伴随着微丝肌动蛋白的形成增加，MRTF－A由胞质向胞核内转位。而我们将HFL－1细胞孵育在细胞松弛素D(2 μmol/L，1 h)，则可以明显抑制高氧所诱导MRTF－A的转位；反之我们使用Jasp(50～200 nmol/L)孵育HFL－1细胞后发现，微丝肌动蛋白的形成增加和胞内MRTF－A向核内转位，表明细胞骨架的聚合和解离调控着MRTF－A向胞核内转位。
MRTF－A基因沉默可抑制高氧诱导的肺成肌纤维细胞的转化和胶原的合成，同时可抑制高氧诱导α－SMA基因启动子MRTF－A的募集。为进一步明确MRTF－A在高氧诱导成肌纤维细胞的转化和胶原的合成中的作用，我们采用siRNA技术使MRTF－A基因沉默，结果显示可抑制高氧诱导的HFL－1细胞表达α－SMA、collagen－Ⅰ蛋白和mRNA水平的增加，同时采用ChIP分析暴露在正常氧和高氧状态下的HFL－1细胞，发现MRTF－A基因沉默可抑制高氧诱导α－SMA基因启动子MRTF－A的募集。
肺纤维化为弥漫性肺间质损伤性疾病，其发病率为1.2～76.4/100 000，患者从诊断明确到死亡的中位时间为2～3年，目前尚有少数药物如尼达尼布可改善肺纤维化患者的肺功能，但尚处于Ⅲ期临床试验中[12,16]。在肺组织中，成纤维细胞是产生胶原细胞外基质的主要效应细胞。然而在许多重症疾病治疗过程中，高氧治疗则是重要手段，但高氧可刺激成纤维细胞增殖和产生胶原蛋白。在高氧的暴露下，成纤维细胞分化成具有收缩力的肺成肌纤维细胞，后者可以产生大量细胞外基质蛋白如胶原。这种具有分化功能的肺成肌纤维细胞可产生特征性分子标志α－SMA，因含有微丝，使得在肺纤维化中具有更强的收缩力[17]。可收缩的成肌纤维细胞使肺实质发生不可逆性的改变，造成坚硬的瘢痕组织在肺组织中堆积并最终破坏肺功能[17]。在我们实验中，也是通过观察α－SMA和collagen－Ⅰ来判断高氧状态下肺成肌纤维细胞表型的转化。我们发现α－SMA和collagen－Ⅰ在高氧暴露的HFL－1细胞中表达明显增高，这一结果与Rehan和Torday[4]报道的结果一致。
高氧暴露所诱导的肺成肌纤维细胞表型转化的机制目前尚不完全清楚。先前有研究报道TGF－β1可诱导肺成肌纤维细胞表型转化和促进成肌纤维细胞合成胶原[18,19,20]。然而又有研究报道TGF－β1不是主要负责高氧诱导的HFL－1成纤维细胞向成肌纤维细胞转化及胶原的合成，而且还发现在HFL－1肺成纤维细胞中，高氧可诱导RhoA的激活以及抑制RhoA的激活可以减少暴露在高氧所诱导的小鼠模型纤维增殖灶中胶原的产生[5]。RhoA属于小G蛋白酶家族成员，可调控许多细胞功能，包括细胞骨架的组装、细胞的发生和发展、转录的调控[21]。高氧可明显影响肌动蛋白细胞骨架，如促进巨噬细胞和内皮细胞中肌动蛋白聚合和应力纤维的形成[5,22]。本研究结果显示HFL－1细胞在95%O2状态下，细胞的微丝肌动蛋白的数量和F－肌动蛋白/G－肌动蛋白比值明显高于正常氧浓度培养下的实验对照组，说明高氧可诱导细胞骨架的组装并可能参与了成肌纤维细胞表型转化，并且可能受RhoA激活的调控。
细胞骨架是一种组织和维持细胞形状的结构系统，参与信号的转导。细胞骨架的改变影响细胞的各个方面，如细胞运动、蛋白合成及信号转导[15,23]。为研究细胞骨架在高氧诱导肺成肌纤维细胞表型转化作用。我们采用Jasp和细胞松弛素D干预细胞骨架的聚合和解离，结果显示使用Jasp稳定肌动蛋白肌微丝能够增加肌动蛋白应力纤维和F－肌动蛋白/G－肌动蛋白比值及能够诱导成肌纤维细胞转化和胶原合成，而使用细胞松弛素D破坏细胞肌动蛋白细胞骨架可抑制高氧诱导的成肌纤维细胞转化和胶原合成。本研究结果表明，在高氧诱导的成肌纤维细胞转化过程中存在G－肌动蛋白向F－肌动蛋白的转变，且细胞骨架在这一过程中扮演着重要角色。
有研究报道F－肌动蛋白聚合增加或G－肌动蛋白减少可以影响转录因子MRTF－A和SRF的激活[10]。MRTF－A属于MRTF家族成员，在各个组织和细胞中广泛表达，因末端含有独特的RPEL通常与G－肌动蛋白结合，被隔离在胞浆中[24,25]。但MRTF－A可以在各种诱导或调控下与G－肌动蛋白解离再转位到细胞核，在细胞核中可结合并增强SRF转录活性，使α－SMA和胶原表达水平明显上调[6]。本研究结果显示，高氧可以促进G－肌动蛋白向F－肌动蛋白转变，及促进MRTF－A向细胞核转位。而且使用细胞骨架稳定剂Jasp发现具有促进上述作用，而细胞骨架细胞松弛素D则具有相反作用。细胞骨架在调控MRTF－A转位的作用可能是通过胞外整合素与细胞表面受体结合经胞内信号激活RhoA，而RhoA的激活又可通过下游ROCK和mDia以促进肌动蛋白聚合，产生大量胶原物质[5,15]。另外，为进一步证明MRTF－A在高氧诱导肺纤维化的作用，我们通过转染含siRNA质粒使MRTF－A基因沉默，研究发现不含有MRTF－A的HFL－1细胞即使在高氧诱导的状态下，α－SMA和胶原的mRNA和蛋白表达水平也明显下降，表明高氧可明显招募MRTF－A进入细胞核促进表达，而MRTF－A基因沉默可以防止高氧诱导的成肌纤维细胞转化和胶原合成。本研究中ChIP结果显示暴露在高氧状态下可增加α－SMA基因启动子MRTF－A的募集，而MRTF－A基因沉默可抑制高氧诱导α－SMA基因启动子MRTF－A的募集，因此高氧促进MRTF－A与α－SMA基因启动子上的转录复合体结合造成α－SMA基因转录和成肌纤维细胞转化。