钛由于其良好的生物力学性能、抗腐蚀性能、低弹性模量而被广泛用于种植体系统[1,2,3]，然而钛本身并不具有抗菌性和抑菌性、不能抵抗蛋白的非特异性黏附[4]，并缺乏生物活性[4,5]。因此，对钛表面进行改性，赋予其抗菌性能，同时促进成骨细胞的黏附和增殖有重要的临床意义[6]。本项研究采用原子转移自由基聚合反应(atom transfer radical polymerization，ATRP)在钛表面接枝聚乙二醇[poly(ethylene glycol)methacrylate，PEG]制备Ti-PEG聚合物分子刷，并进一步在PEG分子链末端接枝精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic，RGD)多肽，制备Ti-PEG-RGD聚合物分子刷，通过研究其对细菌和成骨细胞黏附的影响，探讨使种植体具有抗感染和加速骨结合功能的表面处理方法。
本项研究时间为2014年1月至2015年10月。
氢氧化钠、丙酮、氨丙基三乙氧基硅烷、甲苯、二氯甲烷、三乙胺、2-溴异丁酰溴、溴化亚铜、甲基丙烯酸聚乙二醇酯[乙二醇聚合度为6，oligo(ethylene glycol)monomethacrylate macromonomer，OEGMEMA-6]、N,N,N',N'',N ''-五甲基二乙烯三胺(N,N,N ',N '',N ''-pentamethyldiethylenetriamine, PMDETA)、碳二亚胺／N-羟基丁二酰亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide，EDAC/NHS]、琥珀酸酐、4-二甲基吡啶[4-(dimethylamino)pyridine，DMAP]均购至上海阿拉丁生化科技股份有限公司。脑心浸液(brain heart infusion，BHI)培养基(北京路桥技术股份有限公司)，细菌活性测定试剂盒(Live/Dead BackLight assay kits，南京凯基生物科技发展有限公司)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodified Eagle's medium, DMEM)，胎牛血清，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)，青霉素链霉素溶液-双抗(Hyclone，美国)，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(上海碧云天生物技术有限公司)，RGD多肽(武汉百意欣生物技术有限公司)，钛片(TA1，宝鸡祺鑫钛业有限公司)，变形链球菌(Streptococcus mutans，Sm)(ATCC35668)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii，An)(ATCC12104)、成骨细胞MC3T3均由武汉大学口腔医学生物工程教育部重点实验室提供。
(1)纯钛：钛片打磨抛光，依次用5％氢氧化钠、超纯水超声清洗完成钛表面的羟基化，计为纯钛。
(2)Ti-Br：将纯钛放入25 ml/L氨丙基三乙氧基硅烷的无水甲苯中室温反应18 h，依次用甲苯、二氯甲烷超声清洗；再放入20 ml无水二氯甲烷、10 μl三乙胺、50 μl 2-溴异丁酰溴中冰浴2 h，室温24 h，用二氯甲烷、乙醇、超纯水依次超声清洗，完成钛片表面引发剂的固定，计为Ti-Br。
(3)Ti-PEG：将Ti-Br放入2.52 g OEGMEMA-6、20 ml超纯水、14.5 μl PMDETA、10 mg溴化亚铜的混合溶液中，氩气保护下室温反应48 h，在钛表面接枝PEG聚合物分子刷，计为Ti-PEG。
(4)Ti-PEG-RGD：将Ti-PEG放入0.3 g琥珀酸酐、20 ml无水二氯甲烷、0.24 g 4-二甲基吡啶、600 μl无水三乙胺的溶液中45°回流反应24 h完成羧化，二氯甲烷、乙醇、超纯水超声清洗，记为Ti-PEG-COOH。配制100 ml PBS，加入100 mg NHS, 1 000 mg EDAC，Ti-PEG-COOH室温反应1 h完成羧基活化。取20 mg RGD多肽溶于10 ml PBS，活化后的钛片于4 ℃反应36 h，计为Ti-PEG-RGD。
用接触角测量仪(OCA20，Dataphysics，德国)和X射线光电子能谱(X-rayphotoelectron spectroscopy，XPS)仪(KRATOS XSAM800，KRATOS，英国)对纯钛、Ti-Br、Ti-PEG、Ti-PEG-RGD表面进行表征分析。每组10个钛片，每个钛片检测3次。
Sm和An厌氧培养至A600分别为0.30、0.50。各组钛片紫外线消毒后，加20 μl细菌菌液和2 ml含糖1％的BHI于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h。PBS冲洗去除未黏附细菌，荧光显微镜和扫描电镜观察。
(1)荧光显微镜检测：钛片置于1 ml细菌活性测定试剂盒染料中充分染色，室温下于暗室染色15 min, PBS清洗，荧光显微镜观察。每组每种细菌各检测10个钛片。
(2)扫描电镜检测：钛片避光置于2.5％戊二醛中，4 ℃固定过夜，乙醇梯度脱水，临界点干燥喷金，置于高倍场发射扫描电镜下观察。每组每种细菌各检测10个钛片。
配制含10％胎牛血清和1%双抗的DMEM。成骨细胞MC3T3传至13代后稀释至每1 ml培养介质中含1×105个细胞。各组钛片紫外线消毒后，加入2 ml细胞悬液，37 ℃含5%CO2温箱中培养24 h，PBS冲洗去除未黏附细胞。荧光显微镜(用DAPI对细胞核进行染色)和高倍场发射扫描电镜(2.5％戊二醛室温固定2 h后乙醇梯度脱水)观察。每组每种检测各10个钛片。
纯钛、Ti-Br、Ti-PEG、Ti-PEG-RGD表面接触角分别为<10°、80°、45°、55°；XPS示纯钛表面主要含Ti和O以及环境中不可避免的C污染；引发剂固定后出现N和Br特征峰；接枝PEG后，N、Br几乎消失，并且C含量大幅提高；接枝RGD后N峰较接枝PEG的钛表面明显增强，而500 eV处Na的俄歇峰来自PBS中的钠盐。接枝前后表面接触角的变化及XPS结果证实PEG、PEG-RGD聚合物分子刷成功接枝。
见图1, 图2。荧光显微镜示纯钛表面黏附的细菌较多且密集成团，而Ti-PEG、Ti-PEG-RGD组钛片表面两种细菌数量均较少并散在分布。扫描电镜示纯钛表面细菌间相互交联，且已形成生物膜。Ti-PEG、Ti-PEG-RGD组钛片表面细菌散在分布，细菌间无交联。
见图3, 图4。荧光显微镜显示，纯钛表面细胞核较少，而Ti-PEG组钛片表面细胞核更少，Ti-PEG-RGD钛片上则有大量细胞核。扫描电镜显示，纯钛表面有一定数量的细胞，Ti-PEG钛片上细胞较少，而Ti-PEG-RGD钛片上细胞数量较多，胞质丰富，细胞间紧密连接。
目前，钛表面改性主要有以下两类方法：一是通过表面改性促进成骨细胞的黏附和增殖，从而加速种植体与骨的结合；二是使改性后钛表面具有抗菌性，避免植入后感染。但如何使改性后的种植体表面既能促进成骨细胞黏附又能阻止细菌黏附，相关研究报道较少。本项研究通过ATRP在钛表面接枝PEG以抵抗细菌黏附。PEG有较强的亲水性[7]，能结合大量水分子，在钛片表面形成一层水合层[4,8]，成为细菌、细胞、蛋白质等吸附的屏障[6,9,10]。较多研究显示，材料表面接枝PEG后可见明显的抗细菌黏附效果。Perrin等[11]在硅氮烷基底上进行PEG涂层，发现其对奈瑟菌及梭状芽孢杆菌有显著抗黏附作用。Zhang等[12]通过ATRP对聚二甲基硅氧烷基底改性接枝PEG，制备的PEG分子刷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、成纤维细胞NIH3T3有显著抗黏附作用。Tria等[13]采用电化学沉积结合可逆加成-断裂链转移聚合的方法，在金表面接枝PEG，其对纤维蛋白原和成纤维细胞有明显的抗黏附作用。本项研究通过ATRP在钛表面接枝PEG后，其也显示了对Sm、An、成骨细胞有良好的抗黏附作用。
ATRP是通过化学键接枝高分子的一种简便易行的方法，具有反应条件温和、过程可控、可制备含不同拓扑结构的聚合物及有机或无机杂化材料等一系列优点，还兼具活性聚合的特性，即不存在链终止和链转移等副反应[14]，特别适合在生物医用材料表面接枝生物相容性好的大分子。本项研究通过ATRP在钛表面接枝PEG聚合物分子刷后，由于PEG有较强的亲水性，Ti-PEG表面接触角较Ti-Br小，而接枝RGD后，RGD较PEG疏水，故表面接触角稍增大。根据表面接触角变化结果可推测PEG、RGD接枝至钛表面。而XPS结果显示，纯钛表面主要为Ti、O以及环境中不可避免的C污染；固定引发剂由于采用硅烷偶联剂，故钛表面出现Si、C、N特征峰，之后采用二溴异丁酰溴完成引发剂固定，故出现了Br特征峰；接枝PEG后，PEG的覆盖使钛表面Ti、Br、N含量降低，而PEG高分子链中含大量C，故C含量大幅提高；接枝RGD多肽后，由于多肽含大量氮元素，故N峰较接枝PEG的钛表面明显增强。XPS结果同样证实目标分子被成功接枝于钛表面。
钛表面接枝PEG后，虽然阻止了细菌黏附，但也阻止了成骨细胞黏附，不利于钛种植体与骨形成稳定的结合。RGD是成骨细胞的黏附肽，能促进成骨细胞黏附[15,16,17]，成骨细胞在钛表面的黏附通过RGD多肽与成骨细胞表面的整合素受体结合介导[15,18]。RGD多肽是介导种子细胞与基底黏附的多肽链[19]，在细胞外基质蛋白中可被细胞表面特异性受体识别，该多肽具有调节细胞与胞外基质蛋白附着的作用，将其固定于钛表面可促进成骨细胞黏附与增殖[20,21]。Barber等[22]在钛表面接枝聚(丙烯酰胺-乙二醇)共聚物和聚(丙烯酰胺-丙烯酸)共聚物两种刷子，之后固定RGD，结果显示其可明显促进成骨细胞黏附。胡永成等[21]在同种异体骨表面接枝RGD，能明显促进成骨细胞的黏附和增殖。本项研究在PEG分子末端接枝RGD多肽，结果显示成骨细胞在钛表面有良好的黏附，而Sm、An则难于黏附。这可能是由于钛表面接枝的含PEG和PGD多肽的高分子在体液中呈无规线团结构[23]，高分子链曲折缠绕，从而导致表面既有抗黏附功能的PEG分子链，又有促成骨细胞黏附的RGD多肽。而在对成骨细胞黏附的影响方面，RGD多肽发挥了主要作用。
本项研究在钛表面接枝PEG聚合物分子刷以达到抗细菌黏附的效果，之后在PEG末端接枝RGD进行仿生修饰，结果显示，接枝PEG-RGD不仅能抑制细菌黏附还能促进成骨细胞黏附。
研究钛表面接枝聚乙二醇[poly(ethylene glycol)methacrylate, PEG]-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic，RGD)多肽聚合物分子刷对细菌和成骨细胞黏附的影响，探讨使种植体具有抗感染和加速骨结合功能的表面处理方法。
采用原子转移自由基聚合反应在固定有引发剂2-溴异丁酰溴的钛表面(Ti-Br)接枝PEG(Ti-PEG)，在PEG分子末端接枝RGD多肽(Ti-PEG-RGD)。用接触角测量仪和X射线光电子能谱仪对纯钛、Ti-Br、Ti-PEG和Ti-PEG-RGD进行表征；分别在纯钛组、Ti-PEG组、Ti-PEG-RGD组试件表面进行变形链球菌(Streptococcus mutans，Sm)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii，An)和成骨细胞MC3T3培养，行荧光显微镜和扫描电镜观测。
纯钛、Ti-Br、Ti-PEG、Ti-PEG-RGD表面接触角分别为<10°、80°、45°、55°；X射线光电子能谱显示聚合物分子刷被成功接枝于钛表面。荧光显微镜和扫描电镜显示：纯钛培养Sm和An 24 h后表面黏附大量细菌，而Ti-PEG、Ti-PEG-RGD组细菌黏附较少，且散在分布；成骨细胞在纯钛和Ti-PEG组表面黏附较少，Ti-PEG-RGD组则黏附大量成骨细胞。
钛表面接枝PEG能抑制细菌及成骨细胞黏附，而接枝PEG-RGD不仅能抑制细菌黏附还能促进成骨细胞黏附。