腹膜透析是已广泛应用于终末期肾脏病患者的肾脏替代治疗，然而目前采用的透析液多为生物相容性较差的含糖透析液，长期持续暴露于腹膜透析液可导致腹膜慢性损伤继而发生腹膜纤维化，最终导致腹膜超滤衰竭。巨噬细胞广泛分部于器官和组织中，据不同的微环境分化为不同的亚型。目前最为广泛认可的亚型为经典活化型(classically activated macrophages, M1)及替代活化型(alternatively activated macrophages, M2)。近年来，不少研究证实，作为腹腔免疫的重要组成部分的M2在多种纤维化疾病中发挥重要作用，并且随着M2的清除或抑制，纤维化程度减轻。既往我们已在动物模型中发现高糖溶液通过刺激腹腔巨噬细胞向M2分化以促进腹膜纤维化，清除腹腔M2可有效缓解腹膜纤维化[1]。因此，本研究旨在进一步探索高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化的机制。
小鼠巨噬细胞株Raw 264.7购自American Type Culture Collection (ATCC)，RPMI-1640培养基、澳洲胎牛血清、磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA购自GIBCO公司，青链霉素双抗购自Hyclone公司，D-葡萄糖购自生卫生物工程(上海)有限公司，D-甘露醇购自上海生工生物工程有限公司，Mouse anti Arg-1抗体购自BD公司，PI3K特异性抑制剂LY294002、Rabbit anti pan Akt抗体、Rabbit anti p-Akt抗体购自Cell Signaling Technology (CST)公司，Rabbit anti-mouse CD206抗体购自Abcam公司，DAPI购自Sigma公司。
2.025 g D-葡萄糖溶于50 ml RPMI1640培养基，2.025 g D-甘露醇溶于50 ml RPMI 1640培养基，均由0.22 μm滤器滤过，溶液保存于4℃环境。
小鼠巨噬细胞株Raw 264.7复苏后，用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基在37℃、5% CO2的培养箱。将细胞分为正常对照组、高糖组(4.25%糖浓度)、高渗对照组(4.25%甘露醇)和PI3K抑制剂组(4.25%糖浓度＋PI3K抑制剂)。将细胞种至35 mm培养皿，待细胞长至约80%融合时改用不含血清及双抗的RPMI 1640培养基处理12 h使细胞生长同步化，再用4.25%糖浓度培养基分别刺激4、8和12 h，同时设置高渗对照。
弃去培养基后用4℃遇冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，再弃去液体。加80 μl细胞蛋白裂解液，冰上裂解10 min，用细胞刮刮取细胞蛋白，收集至EP管中(冰上操作)，保存于－80℃或置于冰上。用超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎，500 W、1 s、10次以剪切DNA，降低粘稠度，于4℃，12 500 r/min离心10 min，上清即为细胞总蛋白。
将BSA配成不同浓度的标准品0.5、1和2 mg/ml，取标准品6 μl加入1 ml考马斯亮蓝溶液，涡旋混匀后取200 μl加入96孔板，测量595 nm处的吸光度，并绘制标准曲线；取2 μl蛋白样品加入1 ml考马斯亮蓝溶液，涡旋混匀后取200 μl加入96孔板，根据标准曲线及待测样品稀释倍数读取待测样品蛋白浓度；依据所测蛋白浓度，设定一定体积V，换算后用细胞裂解液配成同一浓度，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮10 min，－20℃储存备用。
取配平好的蛋白，行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳，分离的蛋白转移到PVDF膜上，并孵育相应的一抗、二抗，最后显影，用凝胶图像成像系统成像及进行扫描。
所有计量资料数据以±s表示，多组资料比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组资料间两两比较采用LSD，所有数据均用SPSS 16.0统计学软件处理。以P<0.05为有统计学意义的差异。
在4.25%糖浓度下，CD206作为M2的特异性表面分子呈时间依赖性表达。0 h时Raw 264.7细胞表面无CD206的表达；4 h时CD206在细胞表面开始出现分散的极性表达；至8 h分散的CD206点状信号增强增多，但仍呈极性分布在细胞表面；12 h时，CD206显著增多，呈环状表达在细胞表面(图1)。相应的，作为M2巨噬细胞的功能性酶精氨酸酶1(Arg-1)的表达也呈时间依赖性增加。0 h时，Raw 264.7细胞处于静止状态，基本无Arg-1的表达；至4 h时，Arg-1表达较弱；至8 h时，Arg-1呈环状高表达于细胞表面；至12 h时，Raw 264.7细胞分泌大量的Arg-1包绕浸润细胞，提示Raw 264.7在高糖环境下激活为M2(图2)。Western印迹结果也显示Arg-1的蛋白水平呈时间依赖性增加(图3)。
注：与0 h和4 h比较vs 0 h and 4 h, aP<0.05
利用4.25%甘露糖配制的培养基作为渗透压对照刺激Raw 264.7细胞，结果显示，无论是CD206还是Arg-1的蛋白水平在各时间点的表达均无变化(图4，图5)。说明相对于高糖溶液而言，单纯高渗透压并不会导致巨噬细胞向M2的活化，提示高糖环境中高浓度的糖可能是诱导M2活化的关键因素。
利用高糖刺激Raw 264.7细胞，结果显示在8 h时磷酸化的蛋白激酶B(PKB，又名Akt)表达显著增加，提示PI3K/Akt通路的活化(图6)。
注：与0、4、12 h比较vs 0, 4, and 12 h, aP<0.05
利用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制高糖导致的Akt磷酸化，结果显示在20 μmol/L LY294002作用下，原本在8 h激活的p-Akt受到明显抑制，同时，原本于8 h高表达于细胞表面的Arg-1也被明显抑制(图7)。说明随着PI3K/Akt通路的抑制，高糖环境下M2的活化被显著下调。
注：与NC和4.25% Glucose＋20 μmol/L LY294002比较vs NC and 4.25% Glucose＋20 μmol/L LY294002, aP<0.05
近年来，随着腹膜透析技术的成熟，越来越多尿毒症患者接受腹膜透析治疗，然而含葡萄糖的透析液易诱导产生糖基化终末产物，长期暴露于葡萄糖溶液，导致患者出现腹膜纤维化，进而出现腹膜透析超滤衰竭是阻碍腹膜透析治疗延续性的重要阻碍。临床实践中发现，频繁暴露于高浓度含糖透析液是导致腹膜透析患者腹膜功能减退的重要原因。随着腹透液糖浓度增加，腹膜超滤衰竭发生率显著升高，1.5%和2.5%含糖腹膜透析液极少导致超滤衰竭，而以频繁使用4.25%含糖腹膜透析液最为常见和严重[2]。为了延缓腹膜功能减退，除尽量避免使用高浓度含糖透析液或改用昂贵的不含糖透析液，手段十分有限[3]。基于我们在前期动物实验中观察到的高糖溶液能够刺激腹腔巨噬细胞向M2巨噬细胞分化，在导致腹膜纤维化中发挥重要作用[1]，本组进一步在体外模拟了高糖环境(4.25%葡萄糖溶液)下巨噬细胞向M2的分化，旨在探究高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化的机制。阐明其机制有可能为临床寻找延缓腹膜功能减退的治疗方法提供理论依据。
半乳凝集素3(galectin-3, Gal-3)被认为是调控巨噬细胞向M2活化的重要因子。Gal-3是半乳凝集素家族的一员，其氨基酸序列高度保守，可通过碳水化合物识别区域(CRD)特异性识别β-半乳糖苷[4]。Gal-3的CRD含有晚期糖基化终末产物(AGE)结合位点，是AGE的受体[5]。Gal-3表达于巨噬细胞表面并且可由巨噬细胞分泌，已有研究证实Gal-3在IL-4诱导的M2中呈高表达，且外源性Gal-3可促进巨噬细胞向M2分化[6,7,8]。MacKinnon等[6]证明Gal-3与其受体CD98结合，通过激活PI3K/Akt通路调控巨噬细胞向M2分化，Gal-3-/-、Gal-3特异性抑制剂、CD98特异性抑制剂、PI3K特异性抑制剂均可负性调控IL-4诱导的M2。Gong等[9]也发现TβRII-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞表面Gal-3的mRNA水平明显低于正常小鼠，并提出其骨髓来源的巨噬细胞对于IL-4刺激的低反应性与STAT6及Smad-3无关，而与降低的磷酸化Akt(p-Akt)水平相关。
我们的研究结果显示在4.25%葡萄糖浓度的培养基条件下，小鼠巨噬细胞系Raw 264.7呈时间依赖性向M2激活，M2功能性酶Arg-1、M2表面特异性分子CD206分别在8 h、12 h开始大量表达。值得注意的是，单纯相同渗透压作用下并无上述改变，说明单纯高渗透压不会导致巨噬细胞向M2分化，而高糖溶液可能是导致巨噬细胞替代活化的关键因素。但其机制目前尚不十分清楚。根据文献报道，巨噬细胞的型别转化取决于微环境的差别，经典的替代活化途径在Th2型细胞因子环境下激活，而研究最多的为IL-4/STAT6途径。Mishra等[10]证实感染神经型囊尾蚴病的小鼠巨噬细胞以M2占绝对优势，而M1相关产物则显著减少，但是在STAT6－/－小鼠感染模型中，并未出现明显的M2聚集，提示M2的分化与STAT6密切相关。有研究证实IL-4作用下的小鼠腹腔巨噬细胞高表达Ym-1及精氨酸酶，呈现M2表型，并证明STAT6某一结合位点缺失会导致其对IL-4的反应性降低，说明IL-4诱导M2为STAT6依赖性的[11]。然而此类研究均为外源性IL-4作用下研究的IL-4诱导巨噬细胞替代活化的机制，在高糖、无外源性IL-4条件下巨噬细胞如何分化尚不明确。我们的研究发现高糖溶液作用于小鼠巨噬细胞系Raw 264.7 8 h时出现磷酸化的Akt。Akt即蛋白激酶B(PKB)，其上游为磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，PI3K由p110催化亚基及p85调节亚基构成，p110亚基与p85亚基结合可将底物PIP2转化为PIP3(磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸)，而PIP3对Akt的激活起着关键作用。PIP3结合于PH结构域使得Akt从胞质向细胞膜转移催化自身S124、T450磷酸化，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)的作用下催化T308、S473磷酸化，最终获得Akt的完全活化，实现对下游靶基因的调控。此外，有观点认为PI3K/Akt是启动巨噬细胞替代途径激活的主要信号通路，并提出需要一定基础量的STAT6活化[6]。本研究中我们利用PI3K特异性抑制剂LY294002通过抑制PI3K从而抑制PIP3的生成，阻断了Akt的活化，结果显示随着磷酸化Akt的抑制，M2功能性酶Arg-1明显被抑制，说明PI3K/Akt通路可能参与调控高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化。
但高糖环境经由哪些效应分子介导启动PI3k/Akt途径目前尚无相关研究。有人出一种半乳糖凝集素Galectin-3(Gal-3)可直接促进巨噬细胞向M2分化且IL-4可刺激形成Gal-3分泌正反馈[6]，另有学者则提出Gal-3在IL-4诱导分化的M2中呈高表达[8]。有趣的是，Gal-3既表达于巨噬细胞又可由巨噬细胞分泌，且其受体CD98也高表达于巨噬细胞[7]。高糖环境是否刺激巨噬细胞分泌Gal-3，进而与IL-4互相促进形成正循环，再经由PI3K/Akt伴或不伴IL-4/STAT6通路启动巨噬细胞的替代活化途径，这一假设需要更多深入的研究证实。
腹膜透析是已广泛应用于终末期肾脏病患者的肾脏替代治疗，然而目前采用的透析液多为生物相容性较差的含糖透析液，长期持续暴露于腹膜透析液可导致腹膜慢性损伤继而发生腹膜纤维化，最终导致腹膜超滤衰竭。巨噬细胞广泛分部于器官和组织中，据不同的微环境分化为不同的亚型。目前最为广泛认可的亚型为经典活化型(classically activated macrophages, M1)及替代活化型(alternatively activated macrophages, M2)。近年来，不少研究证实，作为腹腔免疫的重要组成部分的M2在多种纤维化疾病中发挥重要作用，并且随着M2的清除或抑制，纤维化程度减轻。既往我们已在动物模型中发现高糖溶液通过刺激腹腔巨噬细胞向M2分化以促进腹膜纤维化，清除腹腔M2可有效缓解腹膜纤维化[1]。因此，本研究旨在进一步探索高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化的机制。
小鼠巨噬细胞株Raw 264.7购自American Type Culture Collection (ATCC)，RPMI-1640培养基、澳洲胎牛血清、磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA购自GIBCO公司，青链霉素双抗购自Hyclone公司，D-葡萄糖购自生卫生物工程(上海)有限公司，D-甘露醇购自上海生工生物工程有限公司，Mouse anti Arg-1抗体购自BD公司，PI3K特异性抑制剂LY294002、Rabbit anti pan Akt抗体、Rabbit anti p-Akt抗体购自Cell Signaling Technology (CST)公司，Rabbit anti-mouse CD206抗体购自Abcam公司，DAPI购自Sigma公司。
2.025 g D-葡萄糖溶于50 ml RPMI1640培养基，2.025 g D-甘露醇溶于50 ml RPMI 1640培养基，均由0.22 μm滤器滤过，溶液保存于4℃环境。
小鼠巨噬细胞株Raw 264.7复苏后，用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基在37℃、5% CO2的培养箱。将细胞分为正常对照组、高糖组(4.25%糖浓度)、高渗对照组(4.25%甘露醇)和PI3K抑制剂组(4.25%糖浓度＋PI3K抑制剂)。将细胞种至35 mm培养皿，待细胞长至约80%融合时改用不含血清及双抗的RPMI 1640培养基处理12 h使细胞生长同步化，再用4.25%糖浓度培养基分别刺激4、8和12 h，同时设置高渗对照。
弃去培养基后用4℃遇冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，再弃去液体。加80 μl细胞蛋白裂解液，冰上裂解10 min，用细胞刮刮取细胞蛋白，收集至EP管中(冰上操作)，保存于－80℃或置于冰上。用超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎，500 W、1 s、10次以剪切DNA，降低粘稠度，于4℃，12 500 r/min离心10 min，上清即为细胞总蛋白。
将BSA配成不同浓度的标准品0.5、1和2 mg/ml，取标准品6 μl加入1 ml考马斯亮蓝溶液，涡旋混匀后取200 μl加入96孔板，测量595 nm处的吸光度，并绘制标准曲线；取2 μl蛋白样品加入1 ml考马斯亮蓝溶液，涡旋混匀后取200 μl加入96孔板，根据标准曲线及待测样品稀释倍数读取待测样品蛋白浓度；依据所测蛋白浓度，设定一定体积V，换算后用细胞裂解液配成同一浓度，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮10 min，－20℃储存备用。
取配平好的蛋白，行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳，分离的蛋白转移到PVDF膜上，并孵育相应的一抗、二抗，最后显影，用凝胶图像成像系统成像及进行扫描。
所有计量资料数据以
在4.25%糖浓度下，CD206作为M2的特异性表面分子呈时间依赖性表达。0 h时Raw 264.7细胞表面无CD206的表达；4 h时CD206在细胞表面开始出现分散的极性表达；至8 h分散的CD206点状信号增强增多，但仍呈极性分布在细胞表面；12 h时，CD206显著增多，呈环状表达在细胞表面(图1)。相应的，作为M2巨噬细胞的功能性酶精氨酸酶1(Arg-1)的表达也呈时间依赖性增加。0 h时，Raw 264.7细胞处于静止状态，基本无Arg-1的表达；至4 h时，Arg-1表达较弱；至8 h时，Arg-1呈环状高表达于细胞表面；至12 h时，Raw 264.7细胞分泌大量的Arg-1包绕浸润细胞，提示Raw 264.7在高糖环境下激活为M2(图2)。Western印迹结果也显示Arg-1的蛋白水平呈时间依赖性增加(图3)。
注：与0 h和4 h比较vs 0 h and 4 h, aP<0.05
利用4.25%甘露糖配制的培养基作为渗透压对照刺激Raw 264.7细胞，结果显示，无论是CD206还是Arg-1的蛋白水平在各时间点的表达均无变化(图4，图5)。说明相对于高糖溶液而言，单纯高渗透压并不会导致巨噬细胞向M2的活化，提示高糖环境中高浓度的糖可能是诱导M2活化的关键因素。
利用高糖刺激Raw 264.7细胞，结果显示在8 h时磷酸化的蛋白激酶B(PKB，又名Akt)表达显著增加，提示PI3K/Akt通路的活化(图6)。
注：与0、4、12 h比较vs 0, 4, and 12 h, aP<0.05
利用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制高糖导致的Akt磷酸化，结果显示在20 μmol/L LY294002作用下，原本在8 h激活的p-Akt受到明显抑制，同时，原本于8 h高表达于细胞表面的Arg-1也被明显抑制(图7)。说明随着PI3K/Akt通路的抑制，高糖环境下M2的活化被显著下调。
注：与NC和4.25% Glucose＋20 μmol/L LY294002比较vs NC and 4.25% Glucose＋20 μmol/L LY294002, aP<0.05
近年来，随着腹膜透析技术的成熟，越来越多尿毒症患者接受腹膜透析治疗，然而含葡萄糖的透析液易诱导产生糖基化终末产物，长期暴露于葡萄糖溶液，导致患者出现腹膜纤维化，进而出现腹膜透析超滤衰竭是阻碍腹膜透析治疗延续性的重要阻碍。临床实践中发现，频繁暴露于高浓度含糖透析液是导致腹膜透析患者腹膜功能减退的重要原因。随着腹透液糖浓度增加，腹膜超滤衰竭发生率显著升高，1.5%和2.5%含糖腹膜透析液极少导致超滤衰竭，而以频繁使用4.25%含糖腹膜透析液最为常见和严重[2]。为了延缓腹膜功能减退，除尽量避免使用高浓度含糖透析液或改用昂贵的不含糖透析液，手段十分有限[3]。基于我们在前期动物实验中观察到的高糖溶液能够刺激腹腔巨噬细胞向M2巨噬细胞分化，在导致腹膜纤维化中发挥重要作用[1]，本组进一步在体外模拟了高糖环境(4.25%葡萄糖溶液)下巨噬细胞向M2的分化，旨在探究高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化的机制。阐明其机制有可能为临床寻找延缓腹膜功能减退的治疗方法提供理论依据。
半乳凝集素3(galectin-3, Gal-3)被认为是调控巨噬细胞向M2活化的重要因子。Gal-3是半乳凝集素家族的一员，其氨基酸序列高度保守，可通过碳水化合物识别区域(CRD)特异性识别β-半乳糖苷[4]。Gal-3的CRD含有晚期糖基化终末产物(AGE)结合位点，是AGE的受体[5]。Gal-3表达于巨噬细胞表面并且可由巨噬细胞分泌，已有研究证实Gal-3在IL-4诱导的M2中呈高表达，且外源性Gal-3可促进巨噬细胞向M2分化[6,7,8]。MacKinnon等[6]证明Gal-3与其受体CD98结合，通过激活PI3K/Akt通路调控巨噬细胞向M2分化，Gal-3-/-、Gal-3特异性抑制剂、CD98特异性抑制剂、PI3K特异性抑制剂均可负性调控IL-4诱导的M2。Gong等[9]也发现TβRII-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞表面Gal-3的mRNA水平明显低于正常小鼠，并提出其骨髓来源的巨噬细胞对于IL-4刺激的低反应性与STAT6及Smad-3无关，而与降低的磷酸化Akt(p-Akt)水平相关。
我们的研究结果显示在4.25%葡萄糖浓度的培养基条件下，小鼠巨噬细胞系Raw 264.7呈时间依赖性向M2激活，M2功能性酶Arg-1、M2表面特异性分子CD206分别在8 h、12 h开始大量表达。值得注意的是，单纯相同渗透压作用下并无上述改变，说明单纯高渗透压不会导致巨噬细胞向M2分化，而高糖溶液可能是导致巨噬细胞替代活化的关键因素。但其机制目前尚不十分清楚。根据文献报道，巨噬细胞的型别转化取决于微环境的差别，经典的替代活化途径在Th2型细胞因子环境下激活，而研究最多的为IL-4/STAT6途径。Mishra等[10]证实感染神经型囊尾蚴病的小鼠巨噬细胞以M2占绝对优势，而M1相关产物则显著减少，但是在STAT6－/－小鼠感染模型中，并未出现明显的M2聚集，提示M2的分化与STAT6密切相关。有研究证实IL-4作用下的小鼠腹腔巨噬细胞高表达Ym-1及精氨酸酶，呈现M2表型，并证明STAT6某一结合位点缺失会导致其对IL-4的反应性降低，说明IL-4诱导M2为STAT6依赖性的[11]。然而此类研究均为外源性IL-4作用下研究的IL-4诱导巨噬细胞替代活化的机制，在高糖、无外源性IL-4条件下巨噬细胞如何分化尚不明确。我们的研究发现高糖溶液作用于小鼠巨噬细胞系Raw 264.7 8 h时出现磷酸化的Akt。Akt即蛋白激酶B(PKB)，其上游为磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，PI3K由p110催化亚基及p85调节亚基构成，p110亚基与p85亚基结合可将底物PIP2转化为PIP3(磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸)，而PIP3对Akt的激活起着关键作用。PIP3结合于PH结构域使得Akt从胞质向细胞膜转移催化自身S124、T450磷酸化，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)的作用下催化T308、S473磷酸化，最终获得Akt的完全活化，实现对下游靶基因的调控。此外，有观点认为PI3K/Akt是启动巨噬细胞替代途径激活的主要信号通路，并提出需要一定基础量的STAT6活化[6]。本研究中我们利用PI3K特异性抑制剂LY294002通过抑制PI3K从而抑制PIP3的生成，阻断了Akt的活化，结果显示随着磷酸化Akt的抑制，M2功能性酶Arg-1明显被抑制，说明PI3K/Akt通路可能参与调控高糖环境诱导巨噬细胞向M2分化。
但高糖环境经由哪些效应分子介导启动PI3k/Akt途径目前尚无相关研究。有人出一种半乳糖凝集素Galectin-3(Gal-3)可直接促进巨噬细胞向M2分化且IL-4可刺激形成Gal-3分泌正反馈[6]，另有学者则提出Gal-3在IL-4诱导分化的M2中呈高表达[8]。有趣的是，Gal-3既表达于巨噬细胞又可由巨噬细胞分泌，且其受体CD98也高表达于巨噬细胞[7]。高糖环境是否刺激巨噬细胞分泌Gal-3，进而与IL-4互相促进形成正循环，再经由PI3K/Akt伴或不伴IL-4/STAT6通路启动巨噬细胞的替代活化途径，这一假设需要更多深入的研究证实。