周期性发热-阿弗他口炎-咽炎-淋巴结炎11例临床表型及基因特点分析

目的

探讨周期性发热-阿弗他口炎-咽炎-淋巴结炎（PFAPA）患儿的临床特征、血浆细胞因子变化及基因变异特点。

方法

回顾性分析2015年6月至2017年5月深圳市儿童医院诊断的11例PFAPA患儿的临床资料及基因变异特点，选择15名健康体检的儿童为健康对照组，检测患儿及健康对照组血浆细胞因子白细胞介素（IL）1β、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、γ干扰素（IFN-γ）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF），比较患儿发热期与发热间歇期外周血炎症指标[白细胞（WBC）、C反应蛋白（CRP）、血浆淀粉样蛋白（SAA）]及发热期、间歇期与健康对照组血浆细胞因子，组间比较采用t检验；患儿及父母外周血行免疫基因组外显子检测。

结果

11例患儿中男7例，女4例，中位起病年龄24（3~60）月龄，中位诊断年龄69（11~151）月龄，中位发热时长4（1~8）d，发热间歇期1~8周。11例患儿均有周期性发热及咽炎或扁桃体炎，7例有淋巴结炎，5例有口腔溃疡。发热期与间歇期外周血炎症指标: WBC[(14.7±4.1)×10⁹/L比（8.4±1.9）×10⁹/L,t=4.645,P<0.001]，CRP[（24.2±21.1）比（3.3±2.1）mg/L,t=3.286,P=0.040]，SAA[(136.4±47.7)比（7.1±1.1）mg/L,t=7.172,P<0.001]，组间比较差异均有统计学意义。血浆细胞因子检测显示，发热期分别与发热间歇期、健康对照组两两比较，IL-6[（38±10）比（8±4）、（8±5）ng/L，t=6.514、6.830]、IFN-γ[（132±43）比（49±21）、（53±21）ng/L, t=4.069、4.276]、G-CSF[（403±12）比（175±90）、（121±49）ng/L, t=4.219、9.047]升高，差异有统计学意义（P均<0.05）。免疫基因组外显子测序显示8例PFAPA患儿存在MEFV基因杂合变异。

结论

PFAPA临床特征包括周期性发热、咽炎或扁桃体炎、阿弗他口炎及淋巴结炎，当患儿表现为周期性发热伴上述临床症状时需警惕PFAPA，基因测序分析、外周血炎症指标及细胞因子检测有助于诊断此病。

自身炎症性疾病（AIDs）是一种罕见的原发性免疫缺陷病，由固有免疫基因缺陷导致固有免疫失调及促炎症因子过度释放所致，一般不伴特异性抗原、致敏T淋巴细胞和高滴度自身抗体产生^[1]。周期性发热-阿弗他口炎-咽炎-淋巴结炎（PFAPA）是儿童期最常见的AIDs，主要表现为周期性发热、阿弗他口炎、咽炎、淋巴结炎，具体发病机制尚不明确，可能与感染、固有免疫失调及遗传背景相关。PFAPA多于幼年期发病，成年期后缓解，有一定的自限性，预后良好。国内缺乏大样本系统性PFAPA的相关报道，现对深圳市儿童医院收治的11例PFAPA患儿的临床特征、实验室检查、基因突变特点、治疗及预后进行回顾性分析，以提高临床医师对该病的认识。

对象和方法

一、对象

2015年6月至2017年5月深圳市儿童医院诊断的11例PFAPA患儿，符合PFAPA诊断标准并排除感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤性疾病、其他遗传性或明确病因的周期性发热相关疾病（HPF）。健康对照组来源于我院15名体检的健康儿童。所有研究对象的监护人或代理监护人签署知情同意书。本研究已获深圳市儿童医院伦理委员会批准（2013-07-24函；2016-021函）。

二、方法

1．标本采集：

采集患儿发热期、发热间歇期、健康对照组儿童乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血1 ml以行血浆细胞因子检测，患儿及父母EDTA抗凝外周血1 ml分离淋巴细胞用于基因测序。

2．临床资料提取：

回顾性收集并分析11例PFAPA患儿的临床资料，包括年龄、性别、临床特征、辅助检查[白细胞计数（WBC）、C反应蛋白（CRP）、血浆淀粉样蛋白（SAA）、降钙素原、骨髓涂片等]、治疗及预后。比较患儿发热期、发热间歇期外周血炎症指标（WBC、CRP、SAA）。

3．血浆细胞因子检测：

收集数据完整的6例患儿发热期、发热间歇期及15名健康对照组儿童外周静脉血1 ml,参照Milliplex HCYTOMAG-60K试剂盒说明书操作步骤，检测外周血血浆中白细胞介素（IL）1β、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、γ干扰素（IFN-γ）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）水平。4 ℃冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，取出样本，微珠稀释液定容，准备标准品、质控品及血清基质，预洗96孔板，加样，避光室温震荡2 h后，洗板2次，每孔加入25 μl检测抗体。继续孵育1 h后，每孔加入25 μl链霉亲和素藻红蛋白孵育30 min，洗板2次，每孔加入150 μl鞘液，室温避光震荡5 min后，上机检测、数据导出及分析。患儿发热期细胞因子分别与发热间歇期、健康对照组儿童比较。

4．免疫基因序列分析：

PFAPA患儿及其父母外周血分离的淋巴细胞送第三方检验机构（北京迈基诺基因检测公司）行免疫基因组外显子检测（包含MEFV、NLRP3、TNFRSF1A、MVK等基因），并结合患儿临床特征、突变预测、突变位点正常人频率、突变类型等，采用Sanger测序方法验证所有患儿及父母相关的基因变异位点。

三、统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（范围）描述，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般资料

11例PFAPA患儿中男7例，女4例，有阳性家族史者1例（其父有反复发热伴MEFV基因纯合突变），均无近亲婚配史。11例患儿精神运动发育均正常。

二、临床特点

11例PFAPA患儿中位起病年龄24（3~60）月龄，中位诊断年龄69（11~151）月龄，中位发热时长4（1~8）d，发热间歇期1~8周。11例患儿均有周期性发热，发热时均有咽炎或扁桃体炎（明显扁桃体肿大3例），淋巴结炎7例，口腔溃疡5例，畏寒1例，寒战1例，腹痛4例，腹泻1例，关节痛4例，头痛3例，头晕2例，皮疹1例。患儿一般临床资料见表1。

三、辅助检查

11例PFAPA患儿体液免疫及淋巴细胞免疫分析未见明显异常，发热时降钙素原正常（0.08±0.05) μg/L。发热期与间歇期比较，WBC[(14.7±4.1)×10⁹/L比（8.4±1.9）×10⁹/L,t=4.645,P<0.01]，CRP[（24.2±21.1）比（3.3±2.1）mg/L,t=3.286,P=0.040]，SAA[(136.4±47.7)比（7.1±1.1）mg/L,t=7.172,P<0.01],差异均有统计学意义。所有患儿EB病毒、结核、血培养等相关病原学检查均为阴性，胸部CT或胸X线片检查及骨髓细胞学检查未见异常。

四、血浆细胞因子检测结果

1．与健康对照组儿童相比：

PFAPA患儿发热期IL-6、IFN-γ、G-CSF高于健康对照组，差异有统计学意义（P均>0.05）；IL-1β、IL-17、TNF-α组间差异无统计学意义（P均>0.05），见表2。

2.　与发热间歇期相比：

PFAPA患儿发热期IL-6、IFN-γ、G-CSF高于间歇期，差异有统计学意义（P均<0.05）；IL-1β、IL-17、TNF-α组间差异均无统计学意义（P均>0.05），见表2。

五、免疫基因组测序分析

11例PFAPA患儿中，8例发现MEFV基因杂合变异，其中6例为exon2 c.442G>C杂合错义变异,1例同时有exon2 c.442G>C和exon2 c.329T>C两个位点杂合错义变异,1例为exon2 c.605G>A杂合错义变异。11例患儿中均未发现NLRP3、TNFRSF1A、MVK等基因杂合或纯合变异。

六、治疗及预后

所有PFAPA患儿在疑诊AIDs之前均无重症感染病史，多次因"发热"于普通门诊就诊，易诊断为反复呼吸道感染，反复予抗菌药治疗。疑诊或确诊PFAPA后于免疫专科门诊随访，发热时均慎用抗菌药，其中6例患儿发热时单次或2次小剂量泼尼松[0.5 mg/（kg·次）]口服后可快速缓解发热等临床症状；1例患儿更换居住环境后发热间歇期延长；1例患儿口服匹多莫德后发热间歇期延长；1例患儿发热时均伴有明显扁桃体肿大，既往反复抗菌药治疗，诊断PFAPA后在未使用抗菌药情况下，发热症状亦可自行缓解，4个月前扁桃体及腺样体切除术，至今未再发热；1例患儿年满12岁后未再出现周期性发热，期间未予特殊治疗；1例患儿外院就诊后失访。

讨论

PFAPA首次报道于1987年，挪威报道发病率0.23%^[2]，女性发病率略高于男性，无种族特异性，我国暂无相关数据统计。其主要症状有周期性发热伴阿弗他口炎、咽炎、淋巴结炎，偶伴皮疹、关节痛、恶心、呕吐、腹痛、寒战、肌肉疼痛、头痛等。

PFAPA发病机制复杂，基因及遗传背景不清。AIDs相关基因例如MEFV、NLRP3、TNFRSF1A、MVK等基因杂合变异可能与其高度相关。MEFV、NLRP3、TNFRSF1A、MVK被认为是家族性地中海热（FMF）、Cryopyrin相关性周期热综合征（CAPS）、肿瘤坏死因子相关周期热综合征(TRAPS）、高IgD综合征（HIDS）的致病基因，部分PFAPA患儿检测出上述基因的杂合变异^[3]。亚洲人群最常见的是MEFV基因变异，11例患儿中8例存在MEFV基因杂合变异。MEFV是FMF的致病基因，PFAPA患儿存在较高频率的MEFV基因杂合突变。有专家认为，MEFV基因突变是一种增功能变异，可能存在基因剂量效应^[4],MEFV纯合突变导致FMF，MEFV杂合突变表现为PFAPA，这也可以解释PFAPA和FMF临床表型的诸多相似之处。部分MEFV携带者并无周期性发热，调查发现挪威正常人群约20%有MEFV基因变异，PFAPA发病率仅为0.23%，MEFV基因与PFAPA的相关性有待进一步研究。

目前认为PFAPA主要与固有免疫失调，导致炎症因子及趋化因子过度释放有关。既往文献报道炎症因子如IL-6、IFN-γ、G-CSF在发热期会增高^[5,6]，本组数据测定与文献报道基本一致。既往文献报道IL-1β在发热期多增高^[6,7]，本数据显示IL-1β在疾病急性期无增高，可能与例数少和采血时间未在急性期高峰有关。虽然PFAPA非感染因素直接导致，但其发病也可能与扁桃体微生物有关，本组11例患儿发热时均伴有咽炎/扁桃体炎，扁桃体微生物可触发患儿体内失调的炎症反应，产生过多的细胞因子及趋化因子，在趋化因子募集作用下，大量的淋巴细胞和中性粒细胞从外周血募集至扁桃体，引起扁桃体炎症^[8,9]。

PFAPA诊断标准为：（1）周期性发热，起病年龄<5岁；（2）发热时伴有口腔溃疡、咽炎或淋巴结炎；（3）排除周期性中性粒细胞缺乏症；（4）发热间歇期无不适；（5）精神、运动、生长发育正常^[10]。PFAPA鉴别诊断主要包括：（1）感染性疾病包括反复呼吸道感染、EB病毒感染等，但PFAPA病原学检测阴性，发热期降钙素原正常，抗感染治疗无效；（2）周期性中性粒细胞缺乏症：PFAPA无粒细胞缺乏；（3）自身免疫性疾病如幼年特发性关节炎（全身型）、系统性红斑狼疮等：PFAPA发热间歇期炎症指标正常，自身抗体阴性，多系统损害不明显；（4）恶性肿瘤性疾病如白血病、淋巴瘤等：PFAPA发热间歇期无不适，监测血常规三系无明显改变，骨髓细胞学、淋巴结活检、胸腹部CT等检查均正常；（5）其他明确病因的HPF：某些单基因HPF早期易误诊为PFAPA。Gaslini评分系统有助于鉴别，高分患儿提示单基因HPF可能性更大。Gaslini评分的临床和流行病学参数包括早期发病、阳性家族史、胸痛、腹痛、腹泻、口腔溃疡等^[11,12]。PFAPA与FMF鉴别要点包括：（1）FMF呈短期复发性发热，热程多<3 d，伴有浆膜炎、关节痛、丹毒样红斑等；（2）PFAPA对于单剂量或者双次糖皮质激素治疗的有效率可达90%，而多数FMF对于糖皮质激素治疗反应欠佳，多需长期使用秋水仙碱治疗；（3）PFAPA发热间歇期SAA多正常；（4）FMF多为MEFV基因的纯合突变或复合杂合突变，而PFAPA多为MEFV杂合突变；（5）PFAPA有自限性，而FMF预后不良。大约30%的FMF患者表现为MEFV基因的杂合突变，轻型FMF基本无法与PFAPA鉴别，早期可诊断PFAPA，但需密切随访，警惕脉管炎、炎症性肠病、肾脏淀粉样变等FMF严重并发症。

PFAPA治疗目标主要是控制急性期发作和减轻临床症状。一线治疗药物为糖皮质激素。患儿发热第1天单次给予泼尼松0.5~2.0 mg/kg或者倍他米松0.1~0.2 mg/kg可快速缓解发热，若单次给药无效，可再次给药。Vanoni等^[13]在一项纳入301例PFAPA患儿的大样本研究中发现，63%患儿接受单剂量泼尼松1~2 mg/kg后发热快速缓解，32%患儿部分缓解，仅有5%患儿对泼尼松治疗无反应。观察本组8例使用小剂量泼尼松[0.5 mg/（kg·次）]，亦能有效缓解症状。PFAPA的二线治疗包括西咪替丁、秋水仙碱[0.5~1.0 mg/（kg·次）]等。对于发热时均伴扁桃体炎，特别是明显扁桃体肿大的患儿，扁桃体切除术是长期缓解手段。中国儿童PFAPA的最主要表现是反复扁桃体炎。Garavello等^[14]在一项纳入102例PFAPA的前瞻性研究结果显示，99例患儿（97%）在接受扁桃体切除术或扁桃体-腺样体切除术后发热于1~6个月内缓解，仅2例患儿（2%）仍有周期性发热，另1例（1%）进一步研究纠正诊断为HIDS。有专家认为，扁桃体、腺样体是PFAPA患儿自身炎症反应的主要靶器官，靶器官的摘除可减少自身炎症反应的激活。若患儿对糖皮质激素、西咪替丁、秋水仙碱、扁桃体切除术等治疗无反应，IL-1受体阻滞剂如阿那白滞素也可用于PFAPA，但缺乏大样本临床数据^[6]。本组PFAPA患儿常规治疗有效，均未使用IL-1受体阻滞剂。结合我院临床诊治经验，对诊断PFAPA的患儿，可使用小剂量糖皮质激素[0.5 mg/（kg·次）]缓解急性期症状；若患儿伴明显扁桃体肿大，可考虑行扁桃体或扁桃体-腺样体切除术。上述治疗能否改善PFAPA患儿的远期预后尚需大样本多中心的临床数据验证，但急性期缓解症状能有效提高患儿及其家庭的生活质量，减轻家庭经济负担。