糖尿病是继心血管疾病、恶性肿瘤之后，又一严重危害人类健康的慢性疾病，其患病率呈指数上升趋势。2010年我国糖尿病流行病学调查数据显示成年人糖尿病患病率高达11.6%[1]，其中90%以上为2型糖尿病。目前2型糖尿病的治疗方法均无法有效逆转2型糖尿病及其并发症的发生发展。间充质干细胞是一类来源于脂肪、骨髓、脐带等组织的成体干细胞，具有低免疫源性、自我更新和多向分化潜能，自发现以来广泛应用于再生医学的研究[2,3]。迄今为止，MSC在1型糖尿病中的研究较为广泛且深入[4,5]，临床研究已证实MSC可保护新诊断1型糖尿病患者的残存β细胞功能[6]。而目前有关MSC在2型糖尿病中的研究较少，2012年Diabetes杂志上的1项研究提示MSC可改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗，但并未阐明其作用机制[7]。本研究旨在探讨尾静脉注射脐带间充质干细胞对2型糖尿病大鼠的治疗效应并初步探讨其作用机制。
52只雄性SD大鼠(SPF级)，体重(190±10)g，购自解放军总医院医学实验动物中心，动物合格证号：11400700101135。
高脂饲料(D12492，美国)；链脲佐菌素(STZ，sigma，美国)；无血清培养基(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)；胰升糖素抗体(1/1 500)、胰岛素抗体(1/150)(Sigma，美国)；Dil、荧光二抗(Invitrogen，美国)；H33342核染料(1/2 000)；流式抗体CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE(Becton Dickinson，德国)；胰岛素的ELISA试剂盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)。
(1)hMSC的分离、培养及鉴定：无菌条件下采集解放军总医院行剖宫产的足月胎儿脐带，并签署知情同意书。无菌取脐带4～5 cm，PBS充分洗涤，去除血管内残留血液，分离去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带Wharton胶组织，将其尽量剪碎，用0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化18 h后100目筛网过滤，收集滤液，1 000转/min离心，重悬细胞沉淀接种于75 cm2的培养瓶中，添加培养基至10 ml，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，5～6 d第1次换液，以后每2～3 d更换新鲜培养基，当细胞生长至接近85%融合时，使用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，以1∶3比例接种到新的培养瓶中进行传代培养，传至第4代时备用。取生长至85%融合的第4代细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，PBS洗涤3遍后分别加入流式抗体CD45-FITC、CD90-FITC和CD105-PE，相应的人IgG作同型对照，流式细胞仪检测hMSC免疫表型。取生长至85%融合的第4代细胞接种于6孔板后分别选用向脂肪细胞及骨细胞定向分化的培养基培养以诱导其定向分化，并分别采用油红O和茜素红染色鉴定。(2)Dil标记hMSCs：选取第4代hMSC细胞，15 cm一大皿，细胞数约107个，PBS洗涤2遍，以胰蛋白酶溶液消化后1 000转/min离心5 min，2 ml PBS重悬细胞，加入6 μl DIL染料混匀，置37°孵箱5 min，后放置4°冰箱15 min；再次按上述条件离心，2 ml PBS重悬，再次1 000转/min离心洗涤细胞，最后2 ml PBS重悬备用。(3)浓缩hMSC培养上清的制备：同时收集第4代hMSC培养上清，3 000转/min 4℃离心10 min，去除细胞碎片，收集上清，使用7 kDa分子量带式透析器(Union Carbide, CT，美国)4℃条件下10倍浓缩，收集浓缩后的hMSC培养上清备用。
46只体重约190 g雄性SD大鼠采用高脂饲料饲养8周后，禁食12h，一次性腹腔注射25 mg/kg STZ以诱导糖尿病大鼠。STZ注射后连续3 d监测血糖，血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。另6只同期正常饲料饲养大鼠作为对照。所有操作均符合实验动物保护法。
取生长至85%融合的第4代细胞，重悬于PBS中，调整细胞数为3×106/ml。随机选取12只制模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(n＝6)和hMSC治疗组(n＝6)，正常饲养大鼠作为对照组(n＝6)。hMSC治疗组经尾静脉注射3×106hMSCs，糖尿病组经尾静脉注射等量PBS。另随机选取18只制模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(n＝6)、hMSC治疗组(n＝6)和hMSC培养上清治疗组(CM，n＝6)。hMSC治疗组经尾静脉注射3×106hMSCs，hMSC培养上清治疗组经尾静脉注射1ml浓缩hMSC培养上清，糖尿病组经尾静脉注射等量无血清培养基作为对照。余下16只制模成功的糖尿病大鼠经尾静脉输注3×106Dil标记的hMSCs。
hMSC和hMSC培养上清输注后连续每天监测血糖，治疗7d后禁食12h经腹腔注射葡萄糖(2g/kg)或胰岛素(1U/kg)，行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)或胰岛素耐量试验(IPITT)，分别于注射前和注射后30、60、90、120 min检测血糖。ELISA检测空腹胰岛素(FINS)水平。稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)＝空腹血糖(FPG，mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。实验结束后，3%戊巴比妥麻醉大鼠并开胸，PBS经左心室快速灌流至主动脉，再以4%多聚甲醛灌流固定1.5～2 h，取胰腺组织放入30% PB蔗糖中脱水过夜后用包埋剂包埋存于－80℃备用。胰腺组织以7 μm厚度连续切片，进行胰岛素/胰升糖素免疫荧光染色。置于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。每组采用人工计数40个胰岛中的β细胞并求平均值。
随机将输注Dil-hMSCs的糖尿病大鼠分为4组，各组4只，分别在hMSCs输注后3 h、24 h、4 d和7 d处死并留取肺、肝脏和胰腺组织，冰冻连续切片后观察各组织hMSC细胞数。
采用SPSS 17.0软件进行分析，计量数据以
±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
光镜观察第4代hMSC呈成纤维细胞样，细胞大小与形态均一、排列有序(图1A)。定向分化实验结果显示hMSC可成功诱导分化为脂肪细胞(图1B)、骨细胞(图1C)。流式细胞仪检测hMSC表面标记显示：CD90、CD105为阳性表达，阳性率分别为99.76%和99.79%，而CD45为阴性表达，符合国际上对MSC的界定(图1D,图1E,图1F)。
The biological characteristics and identification of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
注：间充质干细胞的形态(A)和成脂(B)、成骨(C)诱导和免疫表型(D、E、F)流式The morphology(A), adipocyte induction(B), osteoblast induction(C)，and the immunologic phenotypes(D、E、F)of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
The biological characteristics and identification of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
hMSC治疗7 d后，体重较糖尿病组略有下降，FPG和HOMA-IR也明显降低(P<0.01)，FINS水平较糖尿病组有升高趋势但无统计学意义(P＝0.211，图2A,图2B,图2C)。IPGTT和IPITT结果显示，hMSC输注后糖耐量及胰岛素敏感性均较糖尿病组明显改善(P<0.01，图2D,图2E,图2F)。
hMSC infusion ameliorated blood glucose and insulin resistance in type 2 diabetic rats
注：NC：正常对照组Normal control group；DM：糖尿病组Diabetes mellitus group；hMSC：人脐带间充质干细胞Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells；HOMA-IR：稳态模型评估的胰岛素抵抗指数Homeostasis model of assessment for insulin resistance index；D：腹腔注射葡萄糖耐量试验Intraperitoneal glucose tolerance test；E：胰岛素耐量试验Insulin tolerance test；与NC组比较vs NC group，aP<0.05；与DM组比较vs DM group，bP<0.05
hMSC infusion ameliorated blood glucose and insulin resistance in type 2 diabetic rats
激光共聚焦显微镜观察胰腺组织胰岛素/胰升糖素免疫荧光染色结果发现，糖尿病组与正常对照组相比，胰岛结构紊乱、β细胞数明显减少，hMSC输注后可修复胰岛结构、明显增加胰岛β细胞数量(图3)，在一定程度上可解释hMSC输注后血清胰岛素水平的升高。
The effect of hMSC infusion on the number of β cells
注：Insulin：胰岛素；Glucagon：胰升糖素；余略语同图2 The other abbreviations are the same as Fig 2；与NC组比较vs NC group，aP<0.05；与DM组比较vs DM group，bP<0.05(Scale bar＝25 μm)
The effect of hMSC infusion on the number of β cells
hMSC输注后3h在肺里可发现少量hMSC，24h肝脏里发现少量hMSC，任何时间段均未在胰腺中发现hMSC，并且hMSC在肺以及肝脏组织中数量非常稀少(图4)。因此推测hMSC在糖尿病中的治疗效果可能源于其分泌效应。
The distribution of hMSCs in lung, liver，and pancreas
注：略语同图2 The abbreviations are the same as Fig 2(Scale bar＝25 μm)
The distribution of hMSCs in lung, liver，and pancreas
hMSC及hMSC培养上清输注7d后，hMSC组和CM组FPG和HOMA-IR均明显降低(P<0.01)，血清FINS水平未见明显改变(图5A,图5B,图5C)，2治疗组间未见统计学差异。胰岛素/胰升糖素免疫荧光染色结果显示，2治疗组均可修复胰岛结构、增加胰岛β细胞数量，疗效相当(图5D)。
The efficacy comparison of hMSC supernatant and hMSC in type 2 diabetic rats
注：CM: hMSC培养上清治疗组hMSC supernatant group；余略语同图2 The other abbreviations are the same as Fig 2；与DM组比较vs DM group，aP<0.05(Scale bar＝25 μm)
The efficacy comparison of hMSC supernatant and hMSC in type 2 diabetic rats
随着生活方式的改变，2型糖尿病患病率明显增加，严重威胁人类健康。胰岛素抵抗及胰岛β细胞的相对缺乏是2型糖尿病的重要特征，目前常见治疗药物如磺脲类、双胍类均是基于改善胰岛素敏感性或者刺激残存β细胞的胰岛素分泌。尽管这些药物能够在一定程度上控制血糖、改善症状，但无法从根本上遏制2型糖尿病并发症如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变及糖尿病大血管病变的发生。所有上市的治疗药物均着眼于控制血糖、延缓并发症的发生，并没有从根本上治愈糖尿病。
间充质干细胞是一类来源广泛、具有多向分化潜能的成体干细胞。早期研究均关注干细胞的多向分化能力，在下肢缺血模型中，干细胞可分化为血管内皮细胞、促进血管再生[8]，而在心肌梗死模型中，干细胞可分化为血管内皮细胞以及心肌细胞从而发挥治疗效应[9]，在不同疾病模型中干细胞可被诱导分化为所需细胞一度成为再生医学研究热点。正因为如此，在糖尿病的研究中，干细胞最早应用于1型糖尿病的治疗。在大剂量STZ诱导的1型糖尿病模型中，尾静脉输注hMSC可以促进β细胞的再生从而改善高血糖状态[4]，但无法证实再生的β细胞来源于hMSC的直接分化。并且在MSC的归巢实验中发现尾静脉输注MSC后，大部分细胞不会通过肺部到达其他脏器如肝脏、胰腺[10,11]。本实验也发现尾静脉输注hMSC后，在胰腺中并未发现hMSC，而胰岛素的靶器官肝脏也仅有极少量的hMSC。因此，推测hMSC在2型糖尿病中的治疗效应可能源于hMSC的分泌效应。
MSC具有广泛的分泌谱，不同培养环境下可分泌不同的细胞因子，低氧环境下大量分泌成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)等[12]，而在炎性环境下主要分泌肝细胞生长因子(HGF)、转化生子因子β(TGF-β)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)[13]，3D环境下培养MSC主要分泌肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(TSG-6)、斯钙素1(STC-1)、前列腺素E2(PGE2)[14,15]。IGF-Ⅰ促进胰岛β细胞复制[16]，VEGF促进血管内皮生成、改善组织血供[12]，TSG-6、PGE2及IDO可改善组织慢性炎症，在心肌梗死、腹膜炎及脓毒血症模型中已被证实[17]。本实验发现输注10倍浓缩的hMSC培养上清可降低糖尿病大鼠血糖、升高血清胰岛素水平，明显改善胰岛素抵抗，疗效与直接输注hMSC相似。但直接输注hMSC疗效更好，可能的原因：(1)hMSC培养上清在体外浓缩的过程中某些细胞因子失活；(2)糖尿病大鼠体内具备低氧、慢性炎症等微环境，hMSC输入体内后由于体内微环境的影响可促使hMSC分泌更多有利于治疗效应的分子，并且hMSC在体外培养是2D培养系统，不同于体内；(3)MSC还具有免疫调节功能[18]，可改善糖尿病大鼠体内慢性炎症状态[19]。
干细胞具有多向分化潜力、可分泌大量细胞因子并具有免疫调节功能，为2型糖尿病治疗提供一个新的选择，在2型糖尿病大鼠中MSC不仅可增加胰岛内β细胞数量、修复胰岛结构，而且可明显改善胰岛素抵抗，能够有效针对2型糖尿病的发病机制发挥治疗效应。并且MSC的治疗效应与其分化功能无关，很大程度上源于其分泌功能。因此，在今后的研究中应当重点筛选出对2型糖尿病治疗有效的分泌因子，并通过体外改变MSC培养环境促进其定向分泌该类因子从而用于2型糖尿病的治疗。由于MSC不仅可改善胰岛素抵抗还能恢复β细胞功能，因此治愈2型糖尿病不是没有可能。
探讨脐带间充质干细胞(hMSC)在2型糖尿病大鼠中的疗效及作用机制。
高脂饲养和小剂量链脲佐菌素诱导建立2型糖尿病模型，经尾静脉输注hMSC或等量10倍浓缩的hMSC培养上清后，每日检测实验大鼠血糖。治疗后第7天行腹腔注射葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。胰腺组织行胰岛素/胰升糖素免疫荧光染色。
干细胞注射后，糖尿病大鼠的空腹血糖和稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)下降(均P<0.01)，糖耐量及胰岛素敏感性均明显改善(均P<0.01)，胰岛内β细胞数量增加。尾静脉输注10倍浓缩hMSC培养上清可在糖尿病大鼠中发挥类似hMSC的治疗效应。
在2型糖尿病大鼠中尾静脉输注hMSC能有效降低血糖、改善胰岛素敏感性，并增加胰岛内β细胞数量，该疗效可能源于hMSC的分泌效应。