肥胖是机体长期能量摄入超过能量消耗，导致能量以三酰甘油的形式在白色脂肪或其他器官过度堆积的结果，其与糖尿病、高血压、血脂异常等慢性疾病的发生密切相关，对人类健康构成巨大威胁^[1]。研究发现，人参皂苷作为人参的主要有效成分之一，具有改善胰岛素抵抗和调节糖脂代谢的作用^[2,3,4]。人参皂苷Rb2(ginsenoside Rb2, Rb2)属于人参二醇型皂苷，在改善糖脂代谢中的作用亦多有研究^[4,5,6]。本课题组的前期研究发现，Rb2能改善肿瘤坏死因子-α诱导的3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗^[7]；通过促进白色脂肪组织棕色化减轻高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重，改善糖耐量异常和胰岛素抵抗^[8]。

自噬是细胞内的一种分解代谢过程，应激条件下通过溶酶体降解多余的细胞结构，维持细胞内稳态，在代谢调节中发挥重要作用^[9]。然而，尚缺乏Rb2是否调节自噬信号通路，并促进棕色化的研究。本研究通过高脂饮食肥胖小鼠模型和3T3-L1脂肪细胞，观察Rb2干预后自噬信号通路和棕色化表型的变化，探讨Rb2对自噬信号通路的影响及自噬在Rb2促进肥胖小鼠白色脂肪棕色化中的作用，以期进一步探讨Rb2改善肥胖的作用机制。

24只6周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2007-0005]，饲养于温州医科大学附属第一医院实验动物中心清洁级动物房，自由摄食与饮水，温度(22±3)℃，湿度50%±5%，每天光照与黑夜时间各为12 h。

Rb2购自上海源叶生物有限公司，10% kcal对照饲料和60% kcal高脂饲料购自江苏美迪森公司，β-actin抗体购自英国Abcam公司，p62、Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)抗体购自美国CST公司，反转录试剂盒购自立陶宛MBI公司，荧光定量PCR试剂盒、荧光定量PCR仪(IQ5)均购自美国BIO-RAD公司。雷帕霉素(rapamycin)购于美国MCE公司。

C57BL/6J雄性小鼠随机分成正常喂养组、正常喂养Rb2干预组、高脂喂养组和高脂喂养Rb2干预组，普通饲料适应2周，正常喂养组予10%kcal对照饲料喂养、高脂喂养组予60% kcal高脂饲料喂食9周，监测体重。造模结束后，正常喂养Rb2干预组和高脂喂养Rb2干预组予40 mg·kg^-1·d^-1 Rb2腹腔注射，时间为早晨9：00～10：00，连续注射10 d，正常喂养组和高脂喂养组予等量磷酸缓冲盐溶液(PBS)相应处理。

小鼠脊髓脱臼处死，75%的乙醇浸泡3～5 min无菌分离小鼠皮下(腹股沟)和内脏(附睾)白色脂肪组织，DMEM/F12冲洗组织，转移入培养皿中，剪成糊状；移入含消化液离心管中(10 mL PBS＋100 μL Hespes缓冲液＋20 mg Ⅱ型胶原酶＋200 mg牛血清白蛋白)，37℃、300转/min摇床晃动30 min，继而2 400转/min离心10 min，液体分3层，弃去上2层，加入DMEM/F12重悬，40 μmol/L滤网过滤细胞悬液，2 400转/min离心10 min，弃上清，加入培养基(DMEM/F12＋10% FBS＋1%双抗＋0.1% Fgf)培养4～6 h，细胞贴壁，可见亮点状脂肪细胞下层灰色细胞，PBS反复洗涤，尽量去除上层成熟脂肪细胞，加入上述培养基培养接触抑制2 d，进行诱导分化。

在37℃，5% CO₂，10% FBS细胞培养液条件下，培养至接触抑制2 d后，经鸡尾酒诱导法诱导方案[3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素]向白色脂肪细胞分化成熟，予以10 μmol/L的Rb2处理2 h。

检测利用Trizol法提取RNA；取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit说明书进行反转录，合成cDNA，然后以其为模板加入引物和SYBR，按说明书进行实时荧光定量PCR分析；实验所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

实验动物禁食12 h后，用水合氯醛麻醉处死小鼠，取附睾旁和腹股沟皮下白色脂肪组织、肩胛部棕色脂肪组织及肝组织称重，部分组织以4%多聚甲醛溶液固定，用于普通病理染色；其余组织液氮速冻，-80℃保存。

取20 mg组织样本，加入200 μL蛋白裂解液(蛋白裂解液∶PMSF为100∶1)，匀浆机研磨均匀。低温离心15 000转/min 20 min，将无色透明上清液移至新的EP管中，BCA法测蛋白浓度，后加入适量上样缓冲液，100℃变性5 min后-20℃低温保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶制备10%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳槽内加入一定量的电泳液，SDS-PAGE胶固定好后放入电泳槽，每孔加入等量蛋白；80 V恒压30 min后，加压至100～120 V恒压，待目的蛋白至电泳夹底部中下时，停止电泳，低温220 mA恒流转膜1 h，5%牛奶封闭液4℃封闭过夜；将抗体与一抗稀释液1∶1 000配制成工作液，4℃水平摇床中孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，山羊抗兔二抗室温水平摇床中孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min；曝光。

应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计量资料用Mean±SD表示，3组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

各组实验小鼠体重、附睾旁和腹股沟皮下白色脂肪组织、肩胛部棕色脂肪组织质量及肝质量(表1)。结果显示，高脂喂养组较正常喂养组小鼠体重、各部位脂肪质量、肝质量明显增加，经Rb2干预后，高脂喂养Rb2干预组体重较高脂喂养组下降了12.02%，附睾旁和腹股沟皮下白色脂肪组织、肩胛部棕色脂肪组织质量较高脂模型分别降低了15.11%、40.69%和10.00%，肝质量亦明显下降(12.88%)，提示Rb2减轻了高脂饮食小鼠的体重、肝质量和各部位脂肪组织质量。

光学显微镜下观察，可见脂滴呈圆形，高脂喂养组较正常喂养组附睾旁和腹股沟皮下白色脂肪组织、肩胛部棕色脂肪组织脂滴明显增大，高脂喂养Rb2干预组较高脂喂养组腹股沟皮下白色脂肪脂滴体积减小，数目减少，附睾旁白色脂肪组织和肩胛部棕色脂肪无明显变化；正常喂养组肝细胞排列呈索状，结构正常；高脂喂养组小鼠肝组织可见细胞质中出现大小不等的脂肪空泡，呈脂肪变性，高脂喂养Rb2干预组与高脂喂养组相比，脂肪空泡数目和体积明显减少，脂肪变性程度减轻(图1)，提示Rb2可以减少高脂饮食小鼠肝脏和腹股沟白色脂肪组织脂滴含量。

注：Rb2：人参皂苷Rb2 Ginsenoside Rb2；iWAT：腹股沟皮下白色脂肪组织Inguinal white adipose tissue；eWAT：附睾旁白色脂肪组织Epididymal white adipose tissue；BAT：肩胛部棕色脂肪组织Interscapular brown adipose tissue; Liver：肝脏；Chow：正常喂养组Normal chow diet group；Chow＋Rb2：正常喂养Rb2干预组Normal chow diet with Rb2 intervention group；HFD：高脂喂养组High-fat diet group；HFD＋Rb2：高脂喂养Rb2干预组High-fat diet with Rb2 intervention group

高脂喂养组较正常喂养组附睾旁、腹股沟白色脂肪组织和肩胛部棕色脂肪组织自噬相关基因(autophagy related gene, Atg)5、Atg7、Beclin-1明显增加，自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增加，p62减少，提示高脂饮食激活了小鼠自噬信号通路；高脂喂养Rb2干预组较高脂喂养组Atg5、Atg7、Beclin-1基因表达下调，自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达下降，p62表达增加(图2)。体外实验显示，3T3-L1脂肪细胞和SVF中，Rb2同样上调了p62蛋白的表达，下调了Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达(图3)。结果提示，Rb2可以抑制脂肪组织和细胞的自噬信号通路。

注：(A)(C)iWAT；(B)(D)BAT；Rb2：人参皂苷Rb2 Ginsenoside Rb2；Chow：正常喂养组Normal chow diet group；Chow＋Rb2：正常喂养Rb2干预组Normal chow diet with Rb2 intervention group；HFD：高脂喂养组High-fat diet group；HFD＋Rb2：高脂喂养Rb2干预组High-fat diet with Rb2 intervention group；iWAT：腹股沟皮下白色脂肪组织Inguinal white adipose tissue；Atg：自噬相关基因Autophagy related gene；BAT：肩胛部棕色脂肪组织Interscapular brown adipose tissue；LC3：微管相关蛋白1轻链3 Microtubule-associated protein 1 light chain 3；vs Chow, ^aP<0.05, ^bP<0.01；vs HFD, ^cP<0.01

注：(A)3T3-L1；(B)SVF；Rb2：人参皂苷Rb2 Ginsenoside Rb2；SVF：基质血管组分Stromal vascular action；LC3：微管相关蛋白1轻链3 Microtubule-associated protein 1 light chain 3；Control：对照组；vs Control, ^aP<0.05, ^bP<0.01

在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化后，分别予Rb2(10、25 μmol/L)、雷帕霉素(100 nmol/L)、雷帕霉素＋Rb2、3-甲基腺嘌呤(10 mmol/L)干预，空白组予等量二甲基亚砜(DMSO)干预，油红O染色，检测3T3-L1脂肪前体细胞在A₄₉₂的吸光度，结果显示分化成熟的脂肪细胞较未分化的脂肪细胞吸光度明显增加，Rb2可以降低3T3-L1细胞的吸光度(表2)。利用雷帕霉素干预3T3-L1脂肪细胞，结果显示雷帕霉素干预组棕色化基因解偶联蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-lα(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、碘甲腺原氨酸脱碘酶2(iodothyronine deiodinase 2, DIO2)和核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1, NRF-1)基因表达下降，而Rb2可以部分逆转雷帕霉素对棕色化相关基因的抑制作用，这可能与其在一定程度上抑制自噬信号表达相关(图4)。

注：Rb2：人参皂苷Rb2 Ginsenoside Rb2；Control：对照组；Rap：雷帕霉素Rapamycin；Atg：自噬相关基因Autophagy related gene；NRF-1：核呼吸因子1 Nuclear respiratory factor 1；DIO2：碘甲腺原氨酸脱碘酶2 Iodothyronine deiodinase 2；PGC-1α：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α；UCP1：解偶联蛋白1 Uncoupling protein 1；vs Control, ^aP<0.05, ^bP<0.01；vs HFD, ^cP<0.01

脂肪组织是人体的主要组成成分之一，其在机体的能量代谢中发挥着重要的作用。脂肪组织作为脂质的主要储存部位，主要由白色和棕色脂肪细胞组成。白色脂肪组织(white adipose tissue)起着维持体温、能量稳态和保护内脏器官等作用；棕色脂肪组织(brown adipose tissue)线粒体含量丰富，其线粒体内膜表面含有大量UCP1，可将化学能转化为热能，提高机体代谢率，维持体温，同时可减轻肥胖和改善代谢异常^[10,11]。在白色脂肪细胞的经典部位，存在着一种形态和功能更接近于棕色脂肪细胞的白色脂肪细胞，称为米色脂肪细胞^[12]。在某些药物、环境或饮食刺激下，白色脂肪组织前体细胞可以向棕色脂肪组织或米色脂肪转化，这一转化过程称为"白色脂肪棕色化"。白色脂肪组织棕色化后具备了部分棕色脂肪组织的功能，将化学能转化为热能，提高机体代谢率，无疑将有助于改善肥胖及2型糖尿病等代谢异常，从而使其成为寻求治疗方法的一个热点。本课题组前期研究显示，Rb2腹腔注射的高脂饮食小鼠出现体重减轻、体脂/体重比下降、糖代谢和胰岛素抵抗得到改善，小鼠腹股沟皮下和附睾旁白色脂肪细胞出现棕色样改变，同时棕色脂肪组织棕色化相关基因和蛋白表达水平亦有所升高^[8]。与动物模型实验结果一致，在经典白色脂肪诱导方案刺激下，Rb2促进棕色脂肪特异性表达基因(如UCP1、PGC-1α、DIO 2、NRF-1)在3T3-L1脂肪细胞和SVF中的表达增加，提示Rb2能促进白色脂肪细胞的棕色化^[8]。

自噬是一种依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的过程。当细胞接受饥饿等诱导自噬的信号后，胞质某处会形成小的类似脂质体样膜结构，继而扩张形成扁平的脂双层吞噬泡结构，胞质中细胞器等物质被包裹起来形成密闭的双层膜自噬体；期间，自噬体的内膜被溶酶体酶降解，产物被输送到胞质中，供细胞重新利用^[9]。因此，在维持细胞能量代谢稳态中发挥着重要作用。近年研究表明，自噬通过溶酶体降解途径也参与了脂肪细胞合成分化的调节过程。肥胖患者脂肪组织自噬水平升高，表现为Atg5在皮下和大网膜脂肪组织中过表达^[13]；肥胖或超重糖尿病患者的脂肪组织自噬水平也明显上调^[14,15]。特异性敲除自噬相关基因Atg5的小鼠，其体重较野生型小鼠轻，胰岛素敏感性增加，对高脂饮食诱导的肥胖具有更强的抵抗力^[16]；特异性敲除自噬相关基因Atg7的小鼠，白色脂肪细胞的生成减少^[17]。相似地，沉默3T3-L1脂肪前体细胞中Atg5、Atg7基因或利用药物抑制自噬将减少脂滴的形成^[18]；敲除小鼠胚胎成纤维(mouse embryo fibroblasts)细胞的Atg5基因，其向白色脂肪诱导分化受到抑制^[16]。进一步研究发现，寒冷等外部刺激会引起米色脂肪细胞的分化生成，当撤除外部刺激之后，米色脂肪细胞会逐步失去形态学和分子特征，重新获得白色脂肪细胞样特征。这个过程中，线粒体自噬被激活，线粒体数目出现下降。当特异性删除脂肪细胞的Atg5或Atg12，抑制线粒体自噬，将减少线粒体的清除，从而阻止外部刺激撤除之后米色脂肪细胞丧失，使其维持高产热能力，抵抗饮食诱导的肥胖，改善胰岛素抵抗^[19]。这些结果提示，自噬在脂肪细胞合成分化过程中起着不可或缺的作用，米色脂肪生成和维持需要抑制自噬过程。本研究显示，Rb2可以促进白色脂肪棕色化，同时伴随着自噬相关基因Atg5、Atg7和Beclin-1的表达下调，自噬信号通路的抑制；在雷帕霉素干预促进自噬激活的情况下，Rb2可以在一定程度上抑制雷帕霉素对自噬信号通路的激活作用，减轻雷帕霉素对白色脂肪棕色化的抑制作用。

综上所述，Rb2可以通过抑制自噬信号通路，促进白色脂肪棕色化，进而改善肥胖。