阿司匹林是目前全球应用最广泛的药物之一，是缺血性心脑血管疾病患者抗血小板治疗的基石[1,2,3]。但是很多规律服用阿司匹林的患者仍无法达到预期的血小板抑制率[4]，这种现象被称为"阿司匹林抵抗"或"阿司匹林低反应性"(aspirin low responsiveness，ALR)。据以往研究结果可知，除环境因素(如药物剂量、患者依从性、患者身体状况等)之外，基因多态性在阿司匹林抵抗中也扮演着重要的角色[4,5,6]。目前研究多集中于阿司匹林作用酶环氧合酶－1、环氧合酶－2[7,8]基因多态性与ALR的相关性上，鲜有研究关注ALR与阿司匹林代谢酶的相关性。
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferases enzymes, UGTs)1A6(UGT1A6)能催化阿司匹林的醛酸化，其基因的单核苷酸多态性(SNPs)可影响UGT1A6酶的活性[9,10]，并最终影响阿司匹林的代谢[11,12]及其治疗效果[13,14]。Nagar等[15]指出人类UGT1A6基因SNPs [rs6759892 (S7A)、rs2070959 (T181A)、rs1105879 (A184S)]和单倍体型UGT1A6*2 (7A＋181A＋184S)可能影响阿司匹林的生化作用和临床疗效。另外有研究表明，单倍体型为UGT1A6*2 (7A＋181A＋184S)的个体催化阿司匹林醛酸化率比UGT1A6*1更高，UGT1A6*2个体药物代谢动力更快[9]。但是，也有其他研究得出了不同结果，认为UGT1A6*2的个体其UGT1A6酶活性比野生型个体更低[11,16]。
我们猜想，不同UGT1A6基因型患者可能对阿司匹林反应性不同。本研究中我们探讨了UGT1A6基因的SNPs位点(rs6759892、rs2070959、rs1105879)与个体阿司匹林反应性之间的相关性。
我们连续纳入了2011年9月至2014年10月在南京卒中注册系统(Nanjing Stroke Registry Program，NSRP)[17]注册的缺血性卒中患者。纳入标准：(1)首发缺血性卒中患者；(2)汉族，年龄≥18岁；(3)在卒中发作后48 h内服用过阿司匹林；(4)有血小板抑制率数据。排除标准：(1)同时服用其他抗凝药物的患者；(2)长期服用其他非甾体类抗炎药(NSAIDs)(>3次/周)；(3)合并严重肝脏疾病和(或)肾脏疾病的患者；(4)合并恶性肿瘤患者。
本研究经南京军区南京总医院伦理委员会批准(批件号：2011GKJ－001)，所有参与者均签署知情同意书。入院时收集患者的基本信息和临床资料。入院后第2天清晨抽取患者空腹外周静脉血用于生化检验和基因分型。
检测血小板功能前，患者须规律服用阿司匹林(100 mg/d)至少7 d，于末剂阿司匹林服用后2～12 h内采集肘静脉血各3 ml于肝素钠抗凝管和枸橼酸钠抗凝管中，混匀，立即送实验室行血栓弹力图检测。血栓弹力图仪根据描记的血栓弹力图自动计算出花生四烯酸诱导的血小板抑制率(AA%)＝1－(MAAA－MAfibrin)/(MAthrombin－MAfibrin)×100%(MAAA为花生四烯酸诱导形成血凝块时得到的最大振幅值；MAfibrin为纤维蛋白诱导形成血凝块时得到的最大振幅值；MAthrombin为凝血酶诱导形成血凝块时得到的最大振幅值)。AA%≤50%定义为ALR。
患者入院后第2天清晨抽取空腹外周静脉血3 ml于乙二胺四乙酸抗凝管中，－80 ℃超低温冻存备用。应用北京天根试剂盒提取DNA后，采用改进的多重连接酶反应技术(iMLDR)进行基因分型，由上海天昊生物科技有限公司提供技术支持。设立空白对照样本和10%重复样本以评估分型结果的可靠性。
数据分析采用SPSS 19.0软件(IBM公司，美国)。偏态分布计量资料用中位数(四分位数)表示，组间比较采用Mann－Whitney U检验；计数资料以频数和率表示，组间比较采用χ2检验。采用goodness－of－fit χ2检验判断各SNPs基因型分布是否符合哈迪－温伯格平衡定律。连锁不平衡采用Haploview 4.2软件进行分析。单倍体型分析采用软件PHASE 2.1。采用广义线性模型分析各SNPs与阿司匹林反应性之间的相关性，各位点分别用显性、隐性、加性遗传模型进行分析。在广义线性模型分析中，AA%为因变量，吸烟、收缩压、总胆固醇为调节变量。P<0.05表示差异有统计学意义。
本研究共纳入缺血性卒中患者323例，其中253(78.3%)例为男性；中位年龄为63.0(55.0，70.0)岁；ALR患者共46例(14.2%)，其中男性36例，详见表1。
 | 表1 研究对象基本信息 |
研究对象基本信息
| 变量 | 女性(n＝70) | 男性(n＝253) | 合计(n＝323) |
|---|---|---|---|
| 年龄(岁) | 63.0(54.0，70.0) | 63.5(57.0，70.0) | 63.0(55.0，70.0) |
| 入院NIHSS评分(分) | 2(0，5) | 2.5(0，6) | 2(0，5) |
| 出院mRS评分(分) | 1(0，2) | 1(0，3) | 1(0，2) |
| AA%(%) | 91.5(66.3，100.0) | 90.8(61.8，100.0) | 91.5(64.8，100.0) |
| ALR[例(%)] | 10(14.3) | 36(14.2) | 46(14.2) |
| 收缩压(mmHg) | 132(125，145) | 132(125，144) | 125(120，132) |
| 体质指数(kg/m2) | 24.2(22.8，26.2) | 24.0(21.5，26.9) | 24.2(22.6，26.4) |
| 总胆固醇(mmol/L) | 3.60(3.00，4.29) | 4.00(3.42，4.85) | 3.66(3.15，4.40) |
| 甘油三酯(mmol/L) | 1.23(0.96，1.69) | 1.37(1.01，1.84) | 1.28(0.96，1.71) |
| HDL(mmol/L) | 0.97(0.83，1.16) | 1.09(0.97，1.31) | 0.99(0.85，1.18) |
| LDL(mmol/L) | 2.11(1.50，2.69) | 2.26(1.79，2.93) | 2.14(1.59，2.71) |
| 高血压[例(%)] | 52(74.3) | 203(80.2) | 255(78.9) |
| 糖尿病[例(%)] | 24(34.3) | 81(32.0) | 105(32.5) |
| 吸烟[例(%)] | 4(5.7) | 147(58.1) | 151(46.7) |
| 饮酒[例(%)] | 2(2.9) | 99(39.1) | 101(31.3) |
| 使用他汀[例(%)] | 53(75.7) | 205(81.0) | 258(79.9) |
| 降压[例(%)] | 42(60.0) | 171(67.6) | 213(65.9) |
注：mRS：改良Rankin量表；AA%：花生四烯酸诱导的血小板抑制率；ALR：阿司匹林低反应性；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白。1 mmHg＝0.133 kPa。表中的计量资料不符合正态分布，因此采用中位数(四分位数)形式表达
本研究3个位点基因分布均符合哈迪－温伯格平衡定律(P>0.05)，详见表2。最小等位基因频率(MAF)分别为：rs6759892 25.7%、rs2070959 23.1%、rs1105879 25.7%，与HapMap数据库中中国北京汉族人群各位点MAF相近。连锁不平衡分析发现3个SNPs位点的连锁率较高(r2 >0.80)。于是我们进行了单倍型分析，发现3个SNPs位点主要有4种组合形式：TAA(74.1%)、TGA (0.2%)、GAC(2.8%)和GGC(22.9%)。
 | 表2 哈迪－温伯格平衡检验 |
哈迪－温伯格平衡检验
| SNPs位点 | MAF | CHB－MAF | χ2值 | HWE－P值 |
|---|---|---|---|---|
| rs6759892 | 0.257 | 0.263 | 2.41 | 0.121 |
| rs2070959 | 0.231 | 0.246 | 1.72 | 0.190 |
| rs1105879 | 0.257 | 0.263 | 2.41 | 0.120 |
SNPs：单核苷酸多态性；MAF：最小等位基因频率；CHB－MAF：中国北京汉族人群的最小等位基因频率；HWE－P值：哈迪－温伯格平衡计算所得P值
如表3所示，rs2070959显性模型β＝0.084、P＝0.010，加性模型β＝0.060、P＝0.033，表明该位点的野生型个体较含突变基因的个体发生ALR的风险更高。男性患者显性模型β＝0.098、P＝0.006，加性模型β＝0.072、P＝0.024，表明这种关系在男性患者中也存在，但在女性患者无显著相关关系(β＝0.040，P＝0.597)。运用Bonferroni校正进行多重比较后，该位点显性模型在所有患者(P校正 ＝0.029)及男性患者(P校正 ＝0.019)中P值仍小于0.05。综上表明，rs2070959位点野生型患者较含突变基因的患者发生ALR的风险增高，尤其是在男性患者中，而且此位点更契合显性遗传模型。
 | 表3 广义线性模型分析单核苷酸多态性及单倍体型与阿司匹林反应性的关系 |
广义线性模型分析单核苷酸多态性及单倍体型与阿司匹林反应性的关系
| SNPs模型 | 女性(n＝70) | 男性(n＝253) | 合计(n＝323) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| β值 | 标准误 | P值 | β值 | 标准误 | P值 | β值 | 标准误 | P值 | |
| rs6759892显性 | －0.016 | 0.074 | 0.834 | 0.087 | 0.036 | 0.015 | 0.062 | 0.032 | 0.054 |
| rs6759892隐性 | －0.006 | 0.152 | 0.966 | －0.016 | 0.085 | 0.849 | －0.008 | 0.074 | 0.916 |
| rs6759892加性 | －0.011 | 0.063 | 0.859 | 0.061 | 0.031 | 0.051 | 0.043 | 0.027 | 0.117 |
| rs2070959显性 | 0.040 | 0.075 | 0.597 | 0.098 | 0.036 | 0.006 | 0.084 | 0.032 | 0.010 |
| rs2070959隐性 | －0.006 | 0.152 | 0.966 | －0.014 | 0.094 | 0.877 | －0.006 | 0.079 | 0.941 |
| rs2070959加性 | 0.024 | 0.063 | 0.698 | 0.072 | 0.031 | 0.024 | 0.060 | 0.028 | 0.033 |
| rs1105879显性 | －0.016 | 0.074 | 0.834 | 0.087 | 0.036 | 0.015 | 0.062 | 0.032 | 0.054 |
| rs1105879隐性 | －0.006 | 0.152 | 0.966 | －0.016 | 0.085 | 0.849 | －0.008 | 0.074 | 0.916 |
| rs1105879加性 | －0.011 | 0.063 | 0.859 | 0.061 | 0.031 | 0.051 | 0.043 | 0.027 | 0.117 |
另外，rs6759892、rs1105879线性模型在所有患者中所得回归系数β为0.087，P＝0.015，表明两位点野生型患者较含突变基因的患者发生ALR的风险增高。我们还分析了单倍体型与阿司匹林反应性之间的关系，发现男性患者的阿司匹林反应性与单倍体型(OR＝1.032, 95% CI 1.002～1.062, P＝0.037, P校正 ＝0.109)也存在一定的相关性。
综上所述，UGT1A6基因rs2070959位点基因多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性相关，其野生型患者(AA)较含突变基因的患者(GA、GG)发生阿司匹林低反应性的风险增高，即阿司匹林对GA、GG个体效果更好。
阿司匹林用于临床已有数百年，以前主要用于解热、镇痛、消炎。自发现其能够不可逆地乙酰化环氧合酶－1第529位丝基酸[18]，进而阻断花生四烯酸生成下游血栓烷素A2，发挥抗血小板聚集作用后，阿司匹林越来越广泛地被用于心脑血管疾病的治疗。大型荟萃分析发现阿司匹林能够显著降低严重血管事件的风险[19,20]。目前美国心脏协会/美国卒中协会推荐阿司匹林可用于缺血性卒中的二级预防和一级预防[2,3]。
但是临床发现，一些规律服用阿司匹林的患者仍然会发生血管事件或实验室检测患者的血小板聚集率仍处于较高水平[4]。研究表明，阿司匹林实验室抵抗与临床抵抗呈正相关，能显著增加患者不良预后[21]。但是其发生机制尚不明确，既往研究表明阿司匹林受多种因素的影响，如阿司匹林剂量、药物依从性、其他非依赖血栓烷素A2的血小板激活途径、基因多态性等[4,22]。其中基因多态性是阿司匹林反应性差异的重要原因之一。目前研究多集中于阿司匹林作用酶环氧合酶－1、环氧合酶－2[7,8]基因多态性，鲜有研究关注ALR与阿司匹林代谢酶的相关性。
UGTs是一个很重要的Ⅱ相代谢酶超家族[23,24,25]。UGTs通过催化葡萄糖醛酸基与底物的结合，参与很多内、外源性物质解毒和代谢[23]。人类UGTs分为两大亚族，UGT1和UGT2。UGT1亚族由13个特异性的外显子1和4个相同的下游外显子(外显子2、3、4、5)构成，包括9个功能性基因(UGT1A1, UGT1A3－UGT1A10)和4个假基因(UGT1A2p, UGT1A11p－UGT1A13p)[23]。其中UGT1A6能催化阿司匹林醛酸化，且其基因的SNPs可能影响UGT1A6酶的催化活性[9,10]，并最终影响阿司匹林的醛酸化率[11,12]及其治疗效果[13,14]。我们对UGT1A6基因的多态性位点与个体阿司匹林反应性的相关性研究发现，UGT1A6基因rs2070959位点基因多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性相关，且三位点遗传模式更契合显性遗传模型。野生型患者(AA)较含突变基因的患者(GA、GG)发生阿司匹林低反应性的风险增高，换言之，rs2070959位点上携带的突变基因G的患者比携带野生基因A的患者对阿司匹林更敏感。
分析其机制可能为，UGT1A6基因多态性影响酶的催化活性，进而影响阿司匹林代谢和作用效果。Xing等[10]在氨基酸水平阐述了UGT1A6基因的rs2070959位点合成该酶的第181位氨基酸。第181位氨基酸位于酶与底物结合的中心位置，当核苷酸由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)时，合成的氨基酸由苏氨酸(Thr)变成了丙氨酸(Ala)，导致酶与底物的结合能力较野生型变弱。综上，携带突变基因(G)的个体可能因此改变了酶与底物阿司匹林的结合能力，而使阿司匹林代谢率降低。在本研究中我们发现UGT1A6多态性位点rs2070959可能与个体间阿司匹林反应性差异有关。且本研究结果与以往研究结果[9,11]相一致。
本研究结果显示，rs2070959的突变等位基因G可能与较低的血小板聚集率相关，基因型为GG、GA的个体可能比AA对阿司匹林更敏感。综上所述，UGT1A6酶的基因多态性可能影响酶的催化活性，进而影响阿司匹林代谢及作用效果。本研究结果可能帮助临床医师在缺血性脑卒中患者的治疗中选择更合适的抗血小板治疗方案。但是本研究为单中心的队列研究，仅采用了一种方法测定血小板功能。虽然我们得出了有统计学意义的结论，但是还有必要进行多中心、大样本量的临床研究来证实，以及进一步的蛋白质组学、功能学研究来阐述UGT1A6 SNPs影响阿司匹林反应性的可能机制。
研究UGT1A6单核苷酸多态性(SNPs)与阿司匹林反应性的关系。
连续纳入2011年9月至2014年10月在南京卒中注册系统注册的缺血性卒中患者。运用血栓弹力图检测所有入组患者血小板功能，采用改进的多重连接酶反应技术检测患者基因型。采用广义线性模型分析SNPs与阿司匹林反应性之间的相关性。
共纳入323例缺血性卒中患者，广义线性模型分析发现，rs2070959的显性模型(β＝0.084, P＝0.010，P校正＝0.029)和加性模型(β＝0.060, P＝0.033)都与血小板抑制率呈显著的正相关。男性患者中，显性模型β＝0.098, P＝0.006，P校正 ＝0.01；加性模型β＝0.072, P＝0.024。表明显性模型中，该位点的野生型个体(AA)较含突变基因的个体(GA、GG)发生阿司匹林低反应性的风险更高。
UGT1A6基因rs2070959位点基因多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性相关，其野生型患者(AA)较含突变基因的患者(GA、GG)发生阿司匹林低反应性的风险增高，这种关系在男性患者中尤为显著。因此检测与阿司匹林代谢相关的基因多态性或实验室检测血小板功能可能有助于临床医师为缺血性卒中患者制定个体化抗血小板治疗方案。