阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD )是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病^[1]，以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征，是导致老年人痴呆的主要原因，其特征性的病理改变是大脑皮质和海马区域神经元数量减少、老年斑沉积或神经原纤维缠结^[2]。在临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。

循环微小RNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其表达水平在多种神经退行性疾病中存在特异变化^[3]。由于miRNA敏感度及特异度较高，检测快速、简单、重复性好，故以miRNA作为标志物快速诊断AD正成为新的研究热点^[4]。目前有关AD研究最多的miRNA有很多，比如：miRNA-9、miRNA-29、miRNA-101、miRNA-106、miRNA-107、miRNA-146家族、miRNA-153等。P62/SQSTM1蛋白(sequestosome 1)是自噬选择性底物，也是miRNA-106b的靶基因之一^[5]。研究表明自噬是细胞的基本功能，自噬功能紊乱与许多疾病相关，已发现P62存在于AD脑组织中的神经原纤维缠结处，是AD和许多慢性退行性疾病的标志物^[6]。

最近的研究表明，AD的发生发展与脂代谢紧密相关，尤其是三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATP binding cassette transport protein A1，ABCA1)调节转运胆固醇与β淀粉样蛋白(β amyloid protein，Aβ)沉积有着密切联系^[7]。载脂蛋白A1(apolipoprotein A1，ApoA1)是一种主要的高密度脂蛋白，其基因变异也可影响蛋白质功能及脑内胆固醇代谢，进而增加AD的发病风险^[8]。

白藜芦醇(resveratrol)是多酚类化合物，主要来源于虎杖、花生、葡萄、桑椹等植物。研究发现白藜芦醇具有广泛的生物学活性，是一种天然的抗氧化剂^[9]。已有较多研究发现白藜芦醇可在一定程度上改善AD动物模型的学习记忆能力^[10]，同时减少脑组织中海马神经元的丢失，但目前关于白藜芦醇对AD中miRNA表达影响的报道很少。故我们通过建立小鼠AD模型，初步研究白藜芦醇对AD小鼠脑组织中miRNA-106b表达的影响，希望能为抗AD新药开发及临床治疗提供理论基础及依据。

无特定病原体级昆明小鼠50只，雄性，体重(22±3) g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2013-0002，使用标准饲料，自由饮水。

白藜芦醇(湖南洪江华光生物有限责任公司，纯度≥98 %，批号：080130)；D-半乳糖(Sigma公司，美国，批号：106K0045)；结晶氯化铝分析纯(广州化学制剂厂，批号：20060501)；抗-淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)抗体(Abcam公司，英国，货号ab32136)；鼠抗β肌动蛋白抗体(杭州联科生物公司，货号mab1445)；抗鼠IgG，辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(Cell Signaling公司，美国)；ReverTra Ace Qpcr逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量Master Mix(TOYOBO公司，日本，货号FSQ101、SCQ101)；Qiagen 205311逆转录试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)。

Centrifuge 5810R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)；Synergy HT型多功能酶标仪(Bio Tek公司，美国)；7500型PCR仪(ABI公司，美国)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；BIO- RAD电泳、转膜及成像系统(BIO- RAD公司，美国)。

将实验小鼠适应性饲养1周，对动物进行称重，20～22 g的分在一组， 23～25 g的分一组，再从这些分好组的动物中按完全随机区组的抽样原则^[11]分为5组：正常对照组、AD模型组、白藜芦醇高、中、低剂量组，每组10只。参照文献[12]造模：对正常对照组每天腹腔注射生理盐水，AD模型组和干预组每天腹腔注射D-半乳糖(120 mg/kg)及氯化铝灌胃(10 mg/kg)，连续30 d。从第31天起在前述基础上白藜芦醇组分别灌胃20、40、80 mg/kg，连续60 d。

于末次给药2 h后进行小鼠跳台实验。开启DT-200小鼠跳台测试箱(成都泰盟科技有限公司)，测试箱的底面铺有铜栅栏，内置有一个绝缘台作为实验对象回避电击的安全区。正式实验开始前将各组实验小鼠放在实验箱内自由活动，以适应环境5 min，然后开始测试：将铜栅栏通电到32 V，小鼠受到电击后，正常反应是跳上跳台回到安全区，躲避电击，如此学习5 min，记录学习成绩(小鼠遭受电击次数)。24 h后进行记忆能力测试，将小鼠直接放在跳台上，记录小鼠跳台错误次数，并以此评价小鼠的记忆能力。每次测试时都要求测试的各种环境因素如灯光、实验员站位等各种参照物要保持一致，而且要保持安静，水温恒定。

采用Trizol法^[13]提取总RNA，检测所提RNA纯度及完整性。RNA样品经逆转录反应合成cDNA模板，然后进行PCR扩增，观察miRNA-106b、ABCA1表达情况。miRNA-106b的上游引物：5'-TAAAGTGCTGACAGTGCA-GAT-3'，下游引物为Qiagen逆转录试剂盒中提供的通用引物。U6的上游引物：5'-GCTTCGGCAGCAC-ATATACTAAAAT-3'；U6下游引物：5'-CGCTTCACG-AATTTGCGTGTCAT-3'。按照SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书进行PCR反应，95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，每次扩增设置U6为内参。ABCA1引物序列：上游5'-GATTGGCTTCAGGATG-TCCATGTTGGAA-3'，下游5'-GTATTTTTGCAAGGC-TACCAGTTACATTTGACAA-3'，PCR扩增产物长度为177 bp；β-肌动蛋白的引物序列：上游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游5'- GCGGCA-GTGGCCATCTC-3'，PCR扩增产物长度为144 bp。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。根据标准曲线扩增效率的一致性，选用2^-ΔΔCt法分析样本中miRNA-106b的相对表达量。

末次给药结束后将各组小鼠脱颈椎处死取脑，解剖显微镜下分离海马组织，按照比例每100 mg组织加入500 μl的细胞裂解液，10 μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，混合研磨后4 ℃离心(12 000 r/min，15 min)，取上清液用BCA法测定蛋白质浓度，每孔上样50 μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，分别加入一抗(APP、P62、ApoA1和β-肌动蛋白抗体)，4 ℃摇床过夜，加入二抗室温孵育2 h，然后加入增强化学发光液显色曝光。检测结果用吸光度法(quantity one)定量，分析各组间海马组织APP、P62、ApoA1的表达水平。

利用PCR法扩增APP的3' UTR序列，所使用的引物为5'-ACCCCCG-CCACAGCAGCCU-3'和5'-CAGCAGCGCACUCGGU-3'。然后将这序列克隆到pGL3荧光素酶的基本载体上，所生成的质粒命名为P3' UTR-APP。我们将P3' UTR-APP与miRNA-106b表达载体或阴性对照质粒共同转染至293T细胞内，转染48 h后收集细胞检测荧光酶素的活性。

采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所有正态分布计量数据用均数±标准差(±s)表示。多组正态分布计量资料的比较和两两比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

与正常对照组相比，AD模型组小鼠的学习记忆能力明显下降(P<0.05)。与AD模型组相比，白藜芦醇干预高、中剂量组小鼠的潜伏期延长，错误次数也明显减少(均P<0.05；表1)。

通过实验发现，AD模型组小鼠大脑miRNA-106b及ABCA1相对表达量较对照组明显降低，而白藜芦醇高、中剂量组处理后均可不同程度上调miRNA-106b及ABCA1水平(图1)。

1：正常对照组，2：阿尔茨海默病(AD)模型组，3、4、5：白藜芦醇低、中、高剂量组；图2同。与正常对照组相比，^aP<0.05(miRNA-106b相对表达量：t＝25.189；ABCA1相对表达量：t＝24.033)；与AD模型组相比，^bP<0.05(miRNA-106b相对表达量：白藜芦醇中剂量组t＝19.900，白藜芦醇高剂量组t＝8.895；ABCA1相对表达量：白藜芦醇中剂量组t＝7.791，白藜芦醇高剂量组t＝4.973)

通过Western印迹法检测各组海马中APP、P62、ApoA1蛋白表达情况发现，与正常对照组相比，AD模型组APP表达明显增加，而P62及ApoA1表达水平较低；与AD模型组相比，白藜芦醇处理后各剂量组均可不同程度下调APP蛋白表达，同时可上调P62、ApoA1的水平，但低剂量组差异没有统计学意义(图2)。

与正常对照组相比， ^aP<0.05(APP相对灰度值：t＝22.853，P62相对灰度值：t＝24.491，ApoA1相对灰度值：t＝23.900)；与AD模型组相比，^bP<0.05(APP相对灰度值：白藜芦醇中剂量组t＝13.100，白藜芦醇高剂量组t＝4.367；P62相对灰度值：白藜芦醇中剂量组t＝10.378，白藜芦醇高剂量组t＝10.241；ApoA1相对灰度值：白藜芦醇中剂量组t＝12.300，白藜芦醇高剂量组t＝2.935)

实验结果显示与对照组相比，miRNA-106b的过表达可明显抑制荧光素酶的活性(图3)。接下来我们利用定点突变法将含有突变序列的APP 3' UTR克隆至载体中，并将此载体称为P3' UTRmut-APP，然后再将P3' UTRmut-APP与miRNA-106b表达载体或阴性对照质粒共同转入293T细胞内。实验结果显示，这两组细胞之间的荧光素酶活性差异无统计学意义(图3)。提示我们miRNA-106b可直接作用于APP mRNA的3' UTR，说明APP是miRNA-106b的靶基因之一。

P3' UTR-APP：APP的3' UTR序列，P3' UTRmut-APP：含有突变的APP 3' UTR序列

目前，有大量研究表明miRNAs参与了AD的发病过程并有可能起着关键作用^[14]。虽然AD的具体发病机制仍不十分明确，但Aβ的产生和聚集被认为是重要因素之一^[15]。Aβ来源于APP的蛋白水解，APP是一种膜蛋白，其生理功能尚未完全阐明，研究表明miRNA可调节APP的水平^[16]。但是淀粉样蛋白假说认为APP的代谢紊乱是AD发病的始动因素，它可以导致Aβ的沉积，尤其是Aβ42。APP及其代谢产物除了发挥正常生理作用外，在AD的发病过程中也起到关键作用。研究发现，APP降解后产生的Aβ，在细胞外聚集形成老年斑影响AD发展进程^[17]。以往的研究及本次研究都验证了miRNA-106b在APP的3'UTR有结合位点，而降低miRNA-106b的表达可能会导致APP蛋白水平的增加，从而影响Aβ的沉积。本次实验结果表明AD模型中miRNA-106b水平是降低的，而APP水平是升高的，进一步验证了miRNA-106b及其靶基因在AD发展中的作用。

研究发现P62作为自噬受体参与蛋白质降解的作用，在部分神经退行性疾病中起作用^[18]，例如，P62参与将AD相关tau蛋白转移到蛋白酶体降解，对AD患者具有保护作用；P62^-/-鼠研究也发现，缺乏P62可引起脑组织多种改变，包括衰老相关的蛋白积聚、神经元死亡等。P62存在于AD脑组织神经原纤维缠结中^[6]，在AD脑组织中，自噬水平升高很可能促进Aβ生成。但关于自噬对神经元的影响研究结果存在争议。有些学者发现敲除小鼠自噬相关基因可引起进行性神经变性，而相反也有学者发现自噬增强可引起神经元死亡^[19]。而实验发现AD模型中P62表达水平较低，而P62是miRNA-106的靶基因之一，这提示我们P62及miRNA-106很有可能与AD发病有关。

miRNA-106能够调节ABCA1^[19]，一种与ApoE脂化和Aβ生产相关的脂质转运体，从而影响Aβ形成。研究发现在AD转基因小鼠体内增加ABCA1的表达可以降低Aβ的沉积，缓解了AD的进展^[20]。这些研究说明了ABCA1在AD发生发展中的重要地位，提示ABCA1很可能是AD进展过程中的一个重要的保护因子。本研究中我们也发现了AD模型中ABCA1的表达水平有所降低，提示ABCA1很可能参与AD进程，进一步验证了之前的研究结果。

由于AD的发生发展与脂代谢紧密相关，而ABCA1又被认为是形成高密度脂蛋白的关键蛋白，正常情况下，经ABCA1转运出细胞的胆固醇与ApoA1共同形成β-高密度脂蛋白，进而形成成熟的高密度脂蛋白^[7]。Lewis等^[21]发现，同时表达APP、PS1、ApoA1的转基因小鼠血清高密度脂蛋白水平明显高于只表达APP和PS1的转基因小鼠高密度脂蛋白水平，同时前者在行为学实验中的表现更接近正常老年鼠的表现，而后者则有空间和学习障碍的表现。所以我们有理由推断ApoA1在AD的进程中作用不可忽视，且很可能是与ABCA1相结合而共同发挥作用。

目前关于miRNAs在AD发病机制中的作用的研究已取得了一定的进展，但仍存在一定的局限性和挑战： (1)每种miRNA可作用于多个靶基因，只研究一种靶基因很有可能忽视了miRNAs的总体反应及各种靶蛋白的相互作用。(2)每个靶基因又很可能受多种miRNAs调控，仅集中于一种miRNA的影响，可能无法反映生物效应的真实性。(3)动物模型对研究疾病的发病机制很重要，但是人体特别复杂，这种结果很难应用到人体上。所以miRNAs对疾病的机制还需要深入探讨。