非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）影响着全球1/4的人口，在我国患病率高达29.6%，目前尚无明确批准的治疗药物^{［1, 2, 3］}。胰高糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂或类似物是已在临床广泛使用的降糖药，具有减重、降糖等多重作用机制^{［4, 5］}。生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是功能多样的转化生长因子β超家族的非典型成员之一^{［6, 7］}。通常情况下，GDF15蛋白以35 kDa全长形式合成，在N末端被切割后，成熟蛋白质以25 kDa二硫键连接的二聚体形式分泌至外周血^［8］。研究表明，GDF15表达水平与NAFLD的发生发展密切相关^{［9, 10］}，GDF15可作为NAFLD的生物标志物^［11］。既往的临床和基础研究发现，GLP-1可改善NAFLD的肝脏脂质沉积^{［12, 13, 14, 15, 16］}。GDF15是否参与了GLP-1改善NAFLD肝脏脂质沉积的作用值得进一步研究。本研究中我们旨在探讨GLP-1对NAFLD状态下GDF15表达与分泌的影响。

人群数据来自前期LIGHT-ON研究^［13］，对NAFLD合并2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者分别给予利拉鲁肽（Novo Nordisk，丹麦，简称GLP-1组）、西格列汀或甘精胰岛素治疗26周，在治疗前后收集患者的临床资料，包括性别、年龄、体重、体重指数（body mass index，BMI）等，通过酶联免疫吸附法测定血清GDF15水平，磁共振成像-质子密度脂肪含量检测肝内脂肪含量（intrahepatic lipid，IHL）。西格列汀用量为100 mg/d，利拉鲁肽和甘精胰岛素起始及加量方法详见文献［13］，26周时利拉鲁肽组和甘精胰岛素组的用量分别为（1.7±0.3）mg、（21.7±9.5）U/d。研究方案经中山大学附属第三医院伦理委员会批准，批准文号为中大附三医伦［2013］2-116（补）1号，所有患者均签署知情同意书。

1.小鼠模型与实验分组：8周龄雄性C57BL/6小鼠（南京动物模式研究所提供）根据体重按随机数字表法分为正常饮食对照组和高脂饮食（high fat diet，HFD）组（各6只），分别给予普通饲料（59%碳水化合物、13%脂肪和28%蛋白质）和高脂饲料（26%碳水化合物、35%脂肪和26%蛋白质，美国Research Diets，D12492）喂养12周。12周后HFD组分别予腹腔注射艾塞那肽（24 nmol·kg??·d??，美国，Lilly）（简称GLP-1组，6只）或生理盐水8周，正常饮食组予腹腔注射等量生理盐水作为对照^{［15，17］}。干预结束后小鼠行麻醉后处死，留取肝脏组织标本，将其分成2份，置于4%多聚甲醛中固定后包埋，行石蜡组织切片，或经液氮快速冷冻后于-80 ℃冰箱保存。以上实验经中山大学实验动物伦理委员会批准，批文号SYSU-IACUC-2018-000234号。

2.细胞模型与干预方法：人HepG2细胞株从中国科学院干细胞库购买。予10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的DMEM培养基培养HepG2细胞。

干预前对HepG2细胞予无血清培养基饥饿4 h。用10%脱脂牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、300 μmol/L棕榈酸钠（sodium palmitate，PA）以及300 μmol/L PA+100 nmol/L Exendin-4（简称GLP-1组）干预HepG2细胞，分别于0、3、6 h检测GDF15 mRNA水平。对HepG2细胞分别予10% BSA、300 μmol/L PA、300 μmol/L PA+1 nmol/L GLP-1、300 μmol/L PA+20 nmol/L GLP-1或300 μmol/L PA+100 nmol/L GLP-1干预6 h，检测GDF15 mRNA水平及细胞上清中GDF15蛋白含量。用10% BSA、10% BSA+100 nmol/L GLP-1、300 μmol/L PA以及300 μmol/L PA+100 nmol/L GLP-1干预HepG2细胞，在6 h检测GDF15 mRNA水平及细胞上清GDF15蛋白含量，并采用油红O染色评估细胞脂质沉积，及GPO-Tinder酶法试剂盒测定HepG2细胞甘油三酯（triglyceride，TG）水平。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，使用插入sgRNA片段的lentiCRISPRv2载体在HepG2细胞中靶向敲除GDF15基因。空白lentiCRISPRv2载体作为阴性对照。转染后24 h加入嘌呤霉素（1 μg/ml）以筛选稳定敲除GDF15基因的细胞和阴性对照细胞。1周后收集细胞及细胞上清，检测细胞上清GDF15蛋白的分泌水平。分别予以10% BSA、10% BSA+100 nmol/L GLP-1、300 μmol/L PA以及300 μmol/L PA+100 nmol/L GLP-1干预转染的HepG2细胞6 h。使用上述方法测定细胞的TG水平。

3.油红O染色及定量分析：用3 mg/ml的油红工作液对小鼠肝脏组织冰冻切片或4%多聚甲醛固定后的HepG2细胞避光室温染色1 h，60%异丙醇漂洗至间质清晰后用磷酸盐缓冲液缓慢冲洗，10%甘油封片，封片后用显微镜观察并采集图像。采集图像后，加入无水异丙醇至染色后的细胞，室温摇匀5 min。吸取200 μl至96孔板，酶标仪检测492 nm波长处吸光度（A值）。

4.免疫荧光：石蜡切片脱蜡后用BSA孵育30 min，封闭后加一抗。切片平放于湿盒内于4 ℃孵育过夜。用磷酸盐缓冲液清洗3遍，使用对应的二抗避光室温孵育50 min，缓慢清洗3遍后滴加DAPI染液室温孵育10 min染核，再次清洗3遍后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

5.实时定量逆转录聚合酶链反应：用TRIzol法提取肝脏组织或HepG2细胞总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。扩增体系：SYBR Green 5.0 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，无酶水3.0 μl，总体积10.0 μl。用Ct（2^-ΔΔCt）比较法计算目的基因的转录水平。

DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素、0.25%胰酶（Gibco，美国）；GDF15酶联免疫吸附法测定试剂盒（R&D，美国）；组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒（普利莱，中国）；逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂（Roche，瑞士）；艾塞那肽（Lilly，美国）；lentiCRISPRv2（Addgene，美国，52961）；10%脱脂BSA（Millipore，美国，126575）；Exendin-4、棕榈酸钠、油红O、嘌呤霉素、TRIzol（Sigma，美国）；F4/80抗体，荧光二抗CY3标记，抗荧光淬灭封片剂（赛维尔生物，中国）。

所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 8绘制统计图。正态分布的连续变量使用x?±s表示。多组连续变量比较采用单因素方差分析，两两比较使用校正后LSD法。采用协方差分析对基线校正后进行治疗后的组间比较。采用配对t检验进行组内干预前后比较。采用Fisher精确检验法比较分类变量。采用Pearson相关分析评估干预前后血清GDF15的改变量（ΔGDF15）与体重改变量（Δ体重）、BMI改变量（ΔBMI）、IHL改变量（ΔIHL）的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

25例NAFLD合并T2DM患者被纳入分析，其中GLP-1组9例（男4例、女5例）、西格列汀组8例（男4例、女4例）、甘精胰岛素组8例（男6例、女2例）。糖尿病病程分别为（4.0±4.8）、（4.9±3.2）和（5.1±3.6）年，患者年龄分别为（43.7±10.5）、（55.1±10.5）和（48.0±8.7）岁。3组患者的性别分布、糖尿病病程和年龄差异均无统计学意义（P值分别为0.479、0.081和0.818）。

各组间治疗前的糖尿病病程、体重、BMI、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A_1c，HbA_1c）、血脂、IHL及血清GDF15水平等差异均无统计学意义（表1）。GLP-1组在26周后血清GDF15水平为（920.3±265.4）pg/ml，比治疗前的（742.2±279.0）pg/ml明显升高，差异有统计学意义（P=0.015）；体重、BMI、IHL明显下降（P均<0.05）。西格列汀组在治疗后IHL同样明显改善，治疗前后分别为（16.2±5.7）%和（11.8±3.1）%，差异有统计学意义（P=0.033），但体重、BMI和血清GDF15水平较治疗前无明显改变。甘精胰岛素组治疗前后的体重、BMI、IHL及血清GDF15差异均无统计学意义。3组治疗前后的HbA_1c均改善（P均<0.05），但三组HbA_1c的改变差异无统计学意义；3组治疗前后的血脂差异均无统计学意义（表1）。GLP-1组ΔGDF15仅与ΔIHL（r=-0.676，P=0.045）存在负相关；与Δ体重（r=-0.547，P=0.128）、ΔBMI（r=-0.562，P=0.116）不具有相关性。

与正常对照相比，HFD组小鼠肝脏组织GDF15 mRNA表达明显上调（P<0.05）。GLP-1干预后，小鼠肝脏GDF15 mRNA表达水平较HFD组进一步升高（P<0.05）（图1A）。

给予高脂饮食喂养12周时，小鼠血糖［分别为（10.4±1.3）和（7.1±1.1）mmol/L］、体重［（42.1±3.2）和（28.9±1.9）g］与正常对照相比明显升高，差异均有统计学意义（P均<0.05）。GLP-1干预8周后，与HFD组小鼠相比，GLP-1组小鼠血糖［（8.0±0.9）和（10.6±0.9）mmol/L，P<0.05］、体重、肝脏TG明显降低（P均<0.05）（图1B，1C）。肝脏组织HE染色及油红O染色表明，HFD组可见大量脂滴及空泡样结构，伴炎症细胞浸润，而在GLP-1组，肝内脂质沉积及炎症状态可见明显改善（图1D）。

1.GLP-1时间依赖性促进GDF15的表达：与对照组相比，PA诱导HepG2细胞的GDF15 mRNA表达水平在6 h上调差异有统计学意义。GLP-1干预后，HepG2细胞的GDF15 mRNA表达水平呈时间依赖性升高，并在6 h较PA组差异有统计学意义（P均<0.05）（图2A）。

2.GLP-1剂量依赖性促进GDF15的表达与分泌：与PA组相比，HepG2细胞在GLP-1干预后胞内GDF15 mRNA表达水平及上清GDF15蛋白含量呈剂量依赖性升高（P均<0.05）（图2B，2C）。

3.GLP-1仅在病理状态下促进GDF15的表达与分泌并改善HepG2细胞脂质沉积：与BSA对照组相比，GLP-1对生理状态下的HepG2细胞中GDF15的表达与分泌的影响差异无统计学意义。而在PA诱导的HepG2细胞中，GLP-1明显促进HepG2细胞GDF15的表达与分泌（P均<0.05）（图3A，3B），表明GLP-1仅在病理状态下促进肝细胞GDF15的表达与分泌。此外，对HepG2细胞进行TG含量测定，PA可诱导细胞内TG含量明显升高，而在GLP-1干预后，细胞内TG含量较PA组显著下降（图3C）。油红O染色及定量分析结果与上述一致，GLP-1干预显著减少PA诱导的HepG2细胞内脂质沉积（图3D，3E）。

注：GLP-1为胰高糖素样肽-1；GDF15为生长分化因子15；10%脱脂牛血清白蛋白（BSA）为对照组；300 μmol/L PA为棕榈酸钠（PA）干预组；1为10%BSA组；2为10%BSA+100 nmol/L GLP-1组；3为300 μmol/L PA组；4为300 μmol/L PA+100 nmol/L GLP-1组；与对照组比较，^aP<0.05；与PA干预组比较，^bP<0.05

与正常对照组相比，HFD组小鼠肝脏组织炎症相关基因F4/80、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α mRNA表达水平显著上调（P均<0.05），而过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator，PGC）1α mRNA表达明显下调（P<0.05）。与HFD组相比，GLP-1组炎症相关基因mRNA表达显著下调（P均<0.05），而促进糖脂代谢相关基因mRNA表达上调（P均<0.05）（图4A4D）。肝脏组织F4/80免疫荧光结果表明GLP-1能显著降低HFD组小鼠的肝脏组织F4/80的表达（图4E）。

注：GLP-1为胰高糖素样肽-1；TNF为肿瘤坏死因子；PGC为过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子；HFD为高脂饮食；与对照组比较，^aP<0.05；与HFD组比较，^bP<0.05

敲除GDF15基因后，HepG2细胞的GDF15蛋白分泌被显著抑制（图5A）。在转染空载体的HepG2细胞中，PA可诱导细胞内TG含量升高、上调炎症基因TNF-α并下调糖脂代谢基因PGC1α mRNA水平，这些变化在给予GLP-1干预后明显逆转（P均<0.05）。相比之下，敲除GDF15基因，GLP-1干预后细胞内TG蓄积，TNF-α和PGC1α mRNA表达水平均无明显改善（图5B5D）。

注：GLP-1为胰高糖素样肽-1；GDF15为生长分化因子15；TNF为肿瘤坏死因子；PGC为过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子；CRISPR-CON为阴性对照组；CRISPR-KO为GDF15敲除组；300 μmol/L PA为棕榈酸钠（PA）干预组；1为10%BSA组；2为10%BSA+100 nmol/L GLP-1组；3为300 μmol/L PA组；4为300 μmol/L PA+100 nmol/L GLP-1组；与阴性对照组比较，^aP<0.05；与PA干预组比较，^bP<0.05

NAFLD是一类以肝脏脂质沉积为病理特点的获得性代谢应激性肝损伤^［18］。既往研究发现，GLP-1可通过减少脂肪从头合成、促进脂肪β氧化等作用减少肝脏脂质沉积，改善胰岛素敏感性^{［19, 20］}。本研究在人群、动物、细胞三个层次上的结果均表明，GLP-1可改善NAFLD的肝脏脂质沉积。

肝脏组织是循环GDF15的主要来源之一^［7］。GDF15可通过减少脂肪合成、促进脂肪利用改善肥胖相关NAFLD^［21］。对GDF15敲除小鼠喂养高果糖高脂饮食，小鼠表现出更显著的肝脏组织炎症及纤维化、更严重的肝内脂质沉积及外周胰岛素抵抗^［7］，说明GDF15可参与调控肝脏脂质代谢。既往研究表明，二甲双胍可剂量依赖性的促进T2DM患者血清GDF15表达水平^［22］。另有研究发现，二甲双胍可上调T2DM患者及HFD小鼠的血清GDF15表达及降低体重，推测二甲双胍可能通过上调GDF15从而抑制食欲进而降低体重^［23］。我们发现，在NAFLD合并T2DM人群上，GLP-1可显著升高血清GDF15水平。进一步相关性分析表明，ΔGDF15与ΔIHL呈负相关关系。提示GDF15可能参与了GLP-1改善NAFLD肝脏脂质沉积的作用。在高脂喂养小鼠及PA诱导的HepG2细胞中，GLP-1可上调肝脏GDF15表达及分泌，这种作用在HepG2细胞中表现为时间及剂量依赖性的升高。且GDF15基因敲除显著削弱了GLP-1改善细胞TG蓄积和炎症的作用。以上结果表明，GLP-1可显著促进肝细胞GDF15的表达与分泌，且GDF15参与了GLP-1改善肝脏的脂质沉积及炎症状态。

我们发现，GLP-1仅在PA诱导的病理状态下促进GDF15的表达与分泌，而在无PA干预的BSA对照组中，GLP-1对GDF15的表达及分泌无明显影响。有研究报道，GDF15敲除小鼠在给予普通饮食时，小鼠的糖脂代谢及肝脏TG含量均无明显变化^［7］。Day等^［23］研究也表明，GDF15的敲除只削弱了二甲双胍在高脂饮食小鼠中的作用，而对普通饮食小鼠无明显影响。因此推测，GDF15可能仅在病理状态下参与GLP-1改善肝脏脂质沉积的作用。

此外，我们发现无论是在高脂饮食喂养的小鼠中，还是在PA诱导的HepG2细胞中，GDF15水平较正常对照组相比均有统计学差异的升高。既往临床研究发现，NAFLD患者血清GDF15水平与其肝脏炎症、气球样变和纤维化的严重程度呈正相关^［11］。长期高脂喂养可上调血清和肝脏GDF15水平^［7］。但过表达GDF15，高脂饮食喂养的C57小鼠肝脏脂质沉积及胰岛素抵抗均得到明显改善^［21］。这种内源性的GDF15增多可能是机体延缓NAFLD进展的一种代偿机制。但仍需进一步研究以阐明其中可能的作用机理。

综上所述，GLP-1可促进GDF15的表达及分泌，并改善NAFLD的肝脏脂质沉积和炎症状态。GDF15可能仅在病理状态下参与GLP-1改善肝脏脂质沉积的作用。