结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，发病率占恶性肿瘤的10%~15%，死亡率居恶性肿瘤的第3位[1,2]。临床上，大部分患者就诊时已属于结直肠癌晚期，因此化疗在结直肠癌的治疗中占有重要地位[3,4]。以奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP）为代表的铂类药物联合化疗被认为是结直肠癌的标准化疗方案[5]。然而实践中发现，该方案的总体治疗效果并不理想，究其原因在于包括针对L-OHP在内的多药耐药（multidrug resistance，MDR）的产生[6]。在之前的研究中我们发现，miR-145能够降低结直肠癌细胞株HCT116的L-OHP耐药性，并且抑制多药耐药基因1（multidrug resistance 1，MDR1）以及其目的蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药蛋白1（multidrug-resistance protein 1，MRP1）的表达，并促进抑癌基因第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的表达（P < 0.05）[7]；然而miR-145究竟是通过何种机制抑制HCT116的L-OHP耐药性尚未有相关报道。本文在上述研究基础上，通过生物信息学预测、鉴定miR-145的靶基因G蛋白偶联受体98（G protein coupled receptor 98，GPR98）并研究其作用，旨在为明确miR-145对人结直肠癌细胞株HCT116耐L-OHP耐药性的作用机制提供依据。
结直肠癌细胞株HCT116购自中国微生物菌种资源库，胰蛋白酶、双抗、RPMI-1640，DMEM和胎牛血清购自美国HyClone公司，L-OHP购自江苏恒瑞医药有限公司，耐药细胞株HCT116/L-OHP、miR-145的模拟体miRNA-mimics及阴性对照NC-miRNA均为本实验前期建立，TRIzol® Reagent和LipofectamineTM 2000脂质体购自美国Invitrogen公司，荧光素酶报告质粒pGL6和过表达质粒pCMV购自上海碧云天生物技术有限公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒购自美国Promega公司，CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所，反转录试剂盒和SYBR® Fast qPCR Mix定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，RIPA裂解液和牛血清白蛋白购自美国Sigma公司，兔抗P-gp（ab129450）抗体购自美国Abcam公司，兔抗PTEN（PA5-15540）和抗MRP1（PA5-30594）抗体，山羊抗兔二抗（65-6120）均购自美国ThermoFisher公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，ECL试剂盒购自美国Amersham公司，引物由上海生工生物公司合成。
结直肠癌细胞株HCT116培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，添加1%双抗，放置在37℃含有5% CO2的培养箱中；每隔3 d用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。耐药细胞株HCT116/L-OHP由本实验前期建立，采用药物浓度递增和间歇诱导的方法获得，同样培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在后续实验进行的前1周停止L-OHP诱导[7]。后续实验使用的HCT116和HCT116/L-OHP细胞株均是处于对数生长期的第2代细胞（经1次传代）。人胚肾细胞HEK-293T使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液，放置在5% CO2的37℃恒温培养箱中。
通过CCK-8法检测，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化后重悬，调整细胞浓度，以2 × 104个细胞·100 μl-1·孔-1的密度接种于96孔板。测定细胞对L-OHP敏感性实验：分别加入不同浓度的L-OHP（0、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/ml）处理72 h，每个浓度设置3个重复孔；随后每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h后，测定每孔在450 nm处的吸光值（A）。以L-OHP浓度为横坐标，细胞生长抑制率作为纵坐标，绘制量效曲线，抑制率=（1-AHCT116/L-OHP/AHCT116）×100%，通过线性回归计算得到纵坐标为50%时对应的横坐标数值，即为被测拮抗剂的半抑制浓度（IC50）。IC50越低，代表对药物的敏感性越强。对于不用L-OHP处理的细胞，分别测量各组在450 nm处的A值，以A450值为纵坐标绘制曲线，检测细胞的增殖能力。
将常规培养的HCT116/L-OHP细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，以1 × 105个细胞/孔的密度接种在6孔板中，常规培养24 h后随机分为3组：HCT116/L-OHPmimics（过表达miR-145组，每孔加入0.2 μg miRNA-mimics），HCT116/L-OHPNC（阴性对照，每孔加入0.2 μg NC-miRNA）和HCT116/L-OHP（空白对照），经LipofectamineTM2000介导转染48 h后，检测miR-145的表达以验证转染效果。
通过TargetScan （http：//www.targetscan.org/）和microRNA.org（http：//www.microrna.org/microrna/home.do/）预测miR-145潜在的靶基因；通过RNAhybrid（http：//bibiserv. techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）预测miR-145在靶基因mRNA 3′-非翻译区（3′-untranslated regions，3′-UTR）的结合序列；根据已有的实验结果和文献报道筛选靶基因，并在图中展示结合序列，初步筛选GPR98为本实验的靶基因。
分离、纯化并扩增包含miR-145结合序列的靶基因GPR98 cDNA片段后，与荧光素酶报告质粒pGL6连接（pGL6-GPR98）；同时，替换GPR98 cDNA片段中miR-145结合序列的部分碱基，与pGL6连接形成突变质粒（pGL6-mutGPR98）。将pGL6-GPR98和pGL6-mutGPR98分别与miRNA-mimics和NC-miRNA用LipofectamineTM 2000脂质体共转染入人胚肾细胞HEK-293T，孵育48 h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒检测GPR98的荧光强度，验证miR-145和GPR98之间的靶向关系。
分离，纯化并扩增GPR98的基因片段，与pCMV连接（pCMV-GPR98），空质粒载体pCMV-vector作为阴性对照。将pCMV-GPR98和pCMV-vector用LipofectamineTM2000分别转染入HCT116/L-OHP细胞，孵育48 h，并以400 μg/ml的G418筛选稳定过表达GPR98的细胞HCT116/L-OHPGPR98和空载体细胞HCT116/L-OHPcontrol，检测GPR98的表达以验证转染效果；此外，将不包含miR-145结合序列的突变质粒pCMV-mutGPR98与miRNA-mimics共转染入HCT116/L-OHP细胞，构建过表达miR-145和GPR98的HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞，并以过表达miR-145的HCT116/L-OHPmimics细胞作为对照。
弃掉培养液加入TRIzol®Reagent后反复吹打细胞，收集细胞溶液用异丙醇法提取细胞的总RNA。应用Nanodrop分光光度计进行RNA定量检测，逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用SYBR®Fast qPCR Mix试剂盒进行定量PCR检测，miR-145上游引物序列为5′-CTCACGGTCCAGTTTTCCCA-3′，下游引物序列为5′-ACCTCAAGAACAGTATTTCCAGG-3′；以U6核内小RNA作为内参基因：上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAAYYYGCGT-3′。GPR98上游引物序列为5′-GGGATGCCCTCTGCATCTTT-3′，下游引物序列为5′-TCACCAGCGTCCTCTCCATA-3′；以β-actin作为内参基因：上游引物序列为5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物序列为5′-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3′。反应条件为95℃ 2 min预变性，95℃ 10 s，55 °C 40 s，72℃ 1 min，共做40个循环。每组实验设置3个平行孔，用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。
弃掉培养液每孔加入1 ml RIPA裂解液在冰上轻轻摇晃10 min，随后反复吹打并收集细胞裂解液，用Bradford方法测定蛋白浓度。取10 μg蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜上，随后在4℃条件下用10%牛血清白蛋白封闭过夜处理。在室温下PVDF膜再经一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜等过程，用ECL发光试剂盒检测目的蛋白的表达。以β-actin作为内参蛋白，条带的定量分析使用Image-Pro Plus 6.0软件。
采用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，计量资料采用
±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，采用Bonferroni法对单因素方差分析有意义的项目进行两两比较。检验水准α= 0.05，P < 0.05表示差异有统计学意义。
HCT116/L-OHP耐药细胞的IC50为（42.34 ± 1.05）μg/ml，高于HCT116细胞的IC50（9.81 ± 0.95）μg/ml，差异有统计学意义（t= 39.784，P= 0.000），两组细胞抑制率曲线见图1a；此外，HCT116/L-OHP细胞miR-145的相对表达水平为0.27 ± 0.04，低于HCT116细胞（1.00 ± 0.09），差异有统计学意义（t= 13.021，P= 0.000），见图1b。
HCT116/L-OHPmimics中miR-145的相对表达水平为10.01 ± 1.05，高于HCT116/L-OHPNC（1.06 ± 0.14）和HCT116/L-OHP（1.00 ± 0.16），差异有统计学意义（F= 161.797，P= 0.000），见图2。
注：1为HCT116/L-OHP；2为HCT116-OHPNC；3为HCT116/L-OHPmimics
初步筛选GPR98为本实验的靶基因。miR-145在GPR98 mRNA的3′-UTR结合序列如图3所示。荧光素酶检测结果显示，与转染NC-miRNA的阴性对照组（1.91 ± 0.19）比较，过表达miR-145后pGL6-GPR98的荧光强度受到抑制（0.33 ± 0.10），差异有统计学意义（t= 12.880，P= 0.000）；而miR-145的过表达并不能影响pGL6-mutGPR98的荧光强度，差异无统计学意义（t= 0.431，P= 0.689），见图3b。
注：1为NC-miRNA；2为MiRNA-mimics
HCT116/L-OHP耐药细胞中GPR98 mRNA和蛋白相对表达水平分别为3.19 ± 0.36和1.48 ± 0.04，与转染NC-miRNA的阴性对照组相近（GPR98 mRNA：3.24 ± 0.36；GPR98蛋白：1.47 ± 0.04），均高于HCT116细胞（GPR98 mRNA：1.00 ± 0.11；GPR98蛋白：1.00 ± 0.09）和过表达miR-145的HCT116/L-OHPmimics细胞（GPR98 mRNA：0.39 ± 0.06；蛋白：0.18 ± 0.03），差异具有统计学意义（mRNA：F=93.923，P= 0.000；蛋白：F= 150.405，P= 0.000），见图4。
HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞的GPR98 mRNA相对表达水平为8.68 ± 0.70，蛋白相对表达水平为1.68 ± 0.13；HCT116/L-OHPGPR98细胞的GPR98 mRNA相对表达水平为8.48 ± 0.46，蛋白相对表达水平为1.71 ± 0.09。两组细胞的GPR98mRNA和蛋白表达水平均高于HCT116/L-OHPcontrol（GPR98 mRNA：3.65 ± 0.40；GPR98蛋白：1.21 ± 0.10）和HCT116/L-OHP（GPR98 mRNA：3.49 ± 0.35；GPR98蛋白：1.22 ± 0.08），差异均具有统计学意义（均P < 0.05），见图5。
过表达GPR98的HCT116/L-OHPGPR98细胞及各组细胞的增殖情况见图6（F= 53.548，P= 0.000）。HCT116/L-OHPGPR98细胞A450值为1.31 ± 0.10，高于HCT116/L-OHP（0.82 ± 0.08），差异具有统计学意义（t= 6.251，P= 0.000）；HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞A450值为0.89 ± 0.08，高于HCT116/L-OHPmimics（0.20 ± 0.05），差异具有统计学意义（t= 11.158，P= 0.000）。
HCT116/L-OHPGPR98细胞中耐药蛋白P-gp和MRP1的相对表达水平分别为1.53 ± 0.18和1.49 ± 0.20，高于HCT116/L-OHP细胞（分别为1.00 ± 0.06和1.21±0.13），而HCT116/L-OHPGPR98细胞抑癌蛋白PTEN的相对表达水平为0.12 ± 0.03，低于HCT116/L-OHP细胞（1.25 ± 0.14），差异均有统计学意义（均P < 0.05）；HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞P-gp和MRP1的蛋白相对表达水平分别为1.02 ± 0.24和1.38 ± 0.25，高于HCT116/L-OHPmimics（分别为0.20 ± 0.07和0.55 ± 0.10），而HCT116/L-OHPmimics+GPR98PTEN的蛋白相对表达水平为1.41 ± 0.16，低于HCT116/L-OHPmimics（1.98 ± 0.13）；差异均有统计学意义（均P < 0.05），见图7。
HCT116/L-OHPGPR98 IC50为（73.54 ± 1.21）μg/ml，约为HCT116/L-OHP IC50[（41.25 ± 1.56）μg/ml]的1.8倍，差异有统计学意义（t= 25.041，P= 0.000）；HCT116/L-OHPmimics+GPR98 IC50为（48.80 ± 1.75）μg/ml，约为HCT116/L-OHPmimics IC50[（19.20 ± 0.81）μg/ml]的2.5倍，差异有统计学意义（t= 22.994，P= 0.000）。4组细胞抑制率曲线见图8。
G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPR）家族是细胞表面最大的分子族群[8]，在信号传导和器官发育中发挥了重要作用[9]，许多学者开始关注GPR与肿瘤发生的关系。有研究显示，GPR在肿瘤的发生发展中扮演了重要角色[10]，在肿瘤组织和细胞中多高表达[11]，其生物学功能包括促进肿瘤细胞的增殖[10]和转移[12]。有学者曾证明GPR49在结直肠癌中的高表达与结直肠癌的发生发展密切相关[13]，然而GPR98在结直肠癌中扮演的角色还未见研究与报道。
miRNA在肿瘤的发生和发展中起重要作用。有文献报道，miR-145通过靶向调节RAD18的表达，能够逆转结直肠癌的5-氟尿嘧啶耐药性[14]。我们的前期研究发现，miR-145的高表达可以降低HCT116细胞的L-OHP耐药性[7]，然而其机制并不清楚。在本研究中，我们证明GPR98是miR-145的靶基因并受其负调控，并且GPR98在HCT116/L-OHP细胞中高表达；通过建立GPR98和miR-145的联合过表达体系，研究GPR98过表达对HCT116/L-OHP细胞增殖和耐药性的效果，结果证明miR-145通过靶向GPR98调节HCT116/L-OHP细胞的耐药性。
有研究显示，MRP1和P-gp在结直肠癌耐药中发挥着重要作用[15,16]。P-gp蛋白是MDR1基因的目的蛋白，也是药泵蛋白之一，能够将抗癌药物以主动转运方式泵至细胞外，使药物在细胞内难以积累达到有效浓度而产生耐药性[17]。MRP1主要介导细胞内外的物质转运，能够作为转运泵将谷胱甘肽-抗癌药物复合物转运出细胞，从而介导肿瘤细胞的耐药性[18]，也是肿瘤细胞出现MDR的原因之一[19]。PTEN是肿瘤抑制基因，其低表达与肿瘤的转移密切相关[20]，也有报道证明PTEN是引起耐药性的原因之一[21]。在本研究中，GPR98的过表达显著促进了P-gp和MRP1的表达，抑制了PTEN的表达，并且GPR98的过表达显著增强了细胞的耐药性，提示MRP1与P-gp的表达增加及两者的共表达，以及PTEN表达的降低，是导致结直肠癌的MDR的重要机制。因此，临床上两种或更多耐药基因的综合检测具有重要意义，一方面可揭示肿瘤的耐药机制，回避无效药物制定有效的治疗方案，预测治疗结果；另一方面可阐述肿瘤耐药的原因，针对耐药基因开发针对性的药物，增强治疗效果。此外，经GPR98过表达处理后miR-145过表达产生的效果被部分逆转，说明miR-145很可能是通过调节GPR98影响细胞的耐药性。总之，联合前期的研究成果，我们发现了miR-145调节HCT116/L-OHP细胞耐药性较完整的分子机制，为减轻结直肠癌的耐药性和探索更有效的治疗方法提供了理论依据。
预测鉴定miR-145靶基因，探讨miR-145抑制结直肠癌细胞株HCT116奥沙利铂（L-OHP）耐药性的机制。
在人结直肠癌细胞株HCT116的基础上，建立人结直肠癌L-OHP耐药细胞株HCT116/L-OHP。脂质体转染法将miR-145的模拟体miRNA-mimics及阴性对照NC-miRNA转染入HCT116/L-OHP，得到过表达miR-145的细胞株HCT116/L-OHPmimics及其阴性对照HCT116/L-OHPNC。预测miR-145的靶基因并用荧光素酶方法验证。确定靶基因为G蛋白偶联受体98（GPR98）后，构建质粒并转染细胞，得到过表达GPR98的HCT116/L-OHPGPR98细胞及其对照HCT116/L-OHPcontrol；同时通过更改GPR98 cDNA中与miR-145结合的序列，得到同时过表达GPR98和miR-145的HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞。本研究采用CCK-8法检测细胞的增殖能力[吸光值（A）]值和对L-OHP的敏感性（被测拮抗剂的半抑制浓度IC50越低，代表对药物的敏感性越强）。实时定量PCR检测miR-145和GPR98的mRNA表达水平；western blot法检测GPR98和耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药蛋白1（MRP1）以及抑癌基因PTEN的蛋白表达水平。
成功建立耐药细胞株HCT116/L-OHP[IC50：（42.34 ± 1.05）μg/ml，高于HCT116细胞的（9.81 ± 0.95）μg/ml，t= 39.784，P= 0.000；miR-145：0.27±0.04，低于HCT116细胞的1.00 ± 0.09，t= 13.021，P= 0.000]。在HCT116/L-OHP基础上，成功构建HCT116/L-OHPmimics细胞[miR-145：10.01 ± 1.05，高于HCT116/L-OHPNC（1.06 ± 0.14）和HCT116/L-OHP（1.00 ± 0.16），F= 161.797，P= 0.000]。GPR98经鉴定是miR-145的靶基因。HCT116/L-OHPGPR98细胞中GPR98的mRNA和蛋白相对表达分别为8.48 ± 0.46和1.71 ± 0.09，与HCT116/L-OHPcontrol（mRNA：3.65 ± 0.40；蛋白：1.21 ± 0.10）和HCT116/L-OHP（mRNA：3.49 ± 0.35；蛋白：1.22 ± 0.08）比较，差异有统计学意义（均P < 0.05）。HCT116/L-OHPGPR98细胞A450值为1.31 ± 0.10，高于HCT116/L-OHP（0.82±0.08，t=6.251，P=0.000）；HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞A450值为0.89 ± 0.08，高于HCT116/L-OHPmimics（0.20 ± 0.05，t= 11.158，P= 0.000）。HCT116/L-OHPGPR98细胞中耐药蛋白P-gp和MRP1的相对表达水平分别为1.53 ± 0.18和1.49 ± 0.20，高于HCT116/L-OHP细胞（分别为1.00 ± 0.06和1.21 ± 0.13），而抑癌蛋白PTEN的相对表达水平为0.12 ± 0.03，低于HCT116/L-OHP细胞（1.25 ± 0.14），差异均有统计学意义（均P < 0.05）。HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞P-gp和MRP1的蛋白相对表达水平分别为1.02 ± 0.24和1.38 ± 0.25，高于HCT116/L-OHPmimics（分别为0.20 ± 0.07和0.55 ± 0.10），而PTEN的蛋白相对表达水平为1.41 ± 0.16，低于HCT116/L-OHPmimics（1.98 ± 0.13），差异均有统计学意义（均P < 0.05）。HCT116/L-OHPGPR98 IC50为（73.54 ± 1.21）μg/ml，高于HCT116/L-OHP的（41.25 ± 1.56）μg/ml（t= 25.041，P= 0.000）；HCT116/L-OHPmimics+GPR98 IC50为（48.80 ± 1.75）μg/ml，高于HCT116/L-OHPmimics的（19.20 ± 0.81）μg/ml（t= 22.994，P= 0.000）。
miR-145通过抑制靶基因GPR98的表达水平，从而抑制人结直肠癌细胞株HCT116细胞的L-OHP耐药性。