先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia, CAH)为常见的常染色体隐性遗传性疾病，由CYP21A2基因缺陷引起的21羟化酶缺乏症(21－hydroxylase deficiency, 21－OHD)为其最常见的病因，占90%～95%[1], 国外报道的发病率为1/10 000～1/20 000[2,3], CYP21A2基因的点突变和大片段缺失均可引起21－OHD。根据21羟化酶活性不同， 21－OHD可分为经典型和非经典型，经典型又包括失盐型(salt－wasting，SW)和单纯男性化型(simple virilizing，SV)[4,5]。回顾分析2009—2014年由各地新生儿筛查发现，并于上海交通大学医学院附属新华医院儿科内分泌/遗传科确诊的66例21－0HD患儿，根据临床表现和生化结果进行表型分类，并进行临床表型和基因型的相关性分析，为21－OHD患儿的临床诊疗和遗传咨询等提供科学依据。
本研究患儿包括男43例，女23例，就诊年龄1月龄内有45例，1～2月龄有17例，2月龄以上有4例。66例患儿中23例为经上海市新生儿筛查发现，余43例为非上海地区筛查后转诊的患儿。
对所有患儿随访并记录其身高、体重、外生殖器发育及皮肤色素沉着，回顾是否有呕吐、腹泻、体重不增、脱水、难以纠正的低血钠和高血钾等肾上腺皮质功能危象的表现。并收集肾上腺皮质相关激素水平检测结果：促肾上腺皮质激素(ACTH)，17－羟孕酮(17－OHP)，皮质醇，睾酮和电解质水平等。
所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意，且本研究项目经过新华医院医学伦理委员会的审核批准(批准文号XHEC－D－015)。
对21－OHD的分型主要依据临床表现和生化检查结果[4,5]。其中属经典型的SW型和SV型患儿均可出现外生殖器女性男性化、男性性早熟等表现，及血ACTH、17－OHP、睾酮等检测水平的升高。SW型患儿可在新生儿期出现肾上腺皮质功能危象的表现，为更严重的表型，而SV型患儿无此失盐的表现。且大部分SW型患儿较SV型男性化程度更为严重，但在出生早期对此难以明显区分。非经典型患儿可在儿童期或青春期出现男性化的表现，较为少见。
(1)Sanger测序：从患儿及其家系的外周血白细胞中用自动化DNA提取仪(厦门至善)提取DNA。使用特异性的引物来扩增两条有重叠的CYP21A2基因片段(P1XP2片段1 519 bp和P3P4片段2 217 bp)，两片段在外显子3到外显子6的区域相互重叠，可特异性地排除假基因CYP21A1P的干扰，PCR扩增的引物参照文献[6]。PCR反应体系(25 μl)如下：DNA模板1.5 μl(200 ng)，正反向引物各0.5 μl(10 μmol/L)，DreamTaq? Green PCR Master MIX 12.5 μl(M7123，Promega, USA)，余体积加水补齐。其中DreamTaq? Green PCR Master MIX包含TaqDNA酶、dNTP(400 μmol/L)、MgCl2和反应缓冲液。PCR扩增反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，63℃(P1XP2)或56 ℃(P1P2)退火40 s，后72 ℃延伸2 min，共进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后送至上海华大基因生物公司纯化和双向测序，测序结果与NCBI/Blaster上CYP21A2基因(NM_000500.7)的标准序列比对。针对患儿发现的突变对其父母DNA进行测序验证。 (2)多重连接探针扩增(MLPA)检测：对经Sanger测序仅发现CYP21A2基因一个突变位点或未能发现突变位点的患儿，采用MLPA(SALSA MLPA probemix P050－C1 CAH)来检测可能的大片段缺失。该MLPA试剂盒共包含37对探针：8对探针特异针对CYP21A2基因的5个外显子(1、3、4、6和7号外显子)、4对探针针对CYP21A1P假基因(1、3、4、7号外显子)，针对TNXB基因和ATF6B基因分别有6对和1对探针，另有8对探针为对照探针。MLPA检测参照试剂盒指定的标准程序操作。对每个MLPA反应，起始DNA量采用100 ng(5 μl体积)，经多重PCR扩增反应后得到的产物用毛细管电泳检测，所得数据采用Coffalyzer data analysis Software (MRC Holland)分析。
上述21－OHD的不同表型分型主要因不同基因突变所致编码的21－羟化酶活性降低程度的不同所致，其中SW型为21－羟化酶活性完全缺乏型，SV型为21－羟化酶活性部分缺乏型，而非经典型则21－羟化酶活性仅有轻度缺乏。根据目前已有的CYP21A2基因突变功能研究的报道为基因型分组归类，并进行相应表型的预测[7,8]。大片段缺失和点突变中的p.G111Vfs*21、 E6 cluster、 p．L308Ffs*6、 p．Q319*、 p．R357W等可引起21－羟化酶活性完全丧失[8]，这些突变的纯合基因型归类为A组；I2G可致所编码的酶仅剩极低的活性[9]，I2G的纯合基因型或I2G和A组突变组成的复合杂合基因型归为B组；p.I173N、p.R484P突变可导致所编码酶剩余约2%的活性[10,11]，这2个突变的纯合基因型或p.I173N、p.R484P其中之一和A组或B组突变组成的复合杂合基因型归为C组；而p.V282L突变则可致所编码的酶剩余20%～60%的活性[12]，p.V282L纯合基因型或p.V282L与A、B、C组中的突变组成的复合杂合基因型归为D组；未确定功能的突变纯合基因型或该突变与上述4组中突变组成的复合杂合基因型归为E组。
对于A和B组的基因型，预测其与较严重的21－OHD SW型相关；C组的基因型，预测与SV型相关；D组的基因型则预测与非经典型相关；而E组的基因型未能根据基因型预测相关的表型。
本研究的66例患儿均因新生儿筛查发现17－OHP浓度异常升高(75.7～1 320 nmol/L，均高于切割值30 nmol/L)[13]而被召回就诊。共有28例患儿出现了呕吐、腹泻、体重不增、脱水等肾上腺皮质功能危象的表现，出现危象的年龄最早为4 d，最晚为2月龄。其中26例患儿因出现呕吐、腹泻、体重不增、脱水等症状来医院就诊，余2例在治疗过程中出现了肾上腺皮质功能危象的表现。另外13例虽就诊前未出现过呕吐、腹泻、体重不增、脱水等症状，但初诊时生化检测已出现低钠、高钾的电解质紊乱，以上41例(62%)患儿均可归类为21－OHD失盐型，其就诊年龄：1例38 d就诊，1例2月龄就诊，5例1月龄就诊，余34例均在4～27 d就诊。另外的25例患儿因在接受治疗前及随访过程中未出现过肾上腺危象或任何失盐的表现，故无法确定其临床表型的分类，其就诊时间：8例12～20 d就诊，7例1月龄时就诊，余10例40 d～5月龄就诊。66例患儿出现肾上腺危象的情况和年龄见表1。
 | 表1 66例21－羟化酶缺乏症患儿治疗前生化检测、基因型和肾上腺危象发生的情况 |
66例21－羟化酶缺乏症患儿治疗前生化检测、基因型和肾上腺危象发生的情况
| 例序 | 性别 | 就诊年龄(d) | 治疗前生化检测结果 | 基因检测结果 | 发生危象年龄(d) | 危象表现 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 17－OHP | ACTH | 睾酮 | 等位基因1(母源性) | 等位基因2(父源性) | |||||
| 1 | 男 | 20 | 500.0 | 215.0 | 1.6 | I2G | p.R357W | 20 | 腹泻、电解质紊乱 |
| 2 | 男 | 4 | 279.0 | 30.0 | 3.9 | I2G | p.R357W | 4 | 呕吐、脱水 |
| 3 | 男 | 19 | 76.0 | 203.0 | 1.7 | I2G | p.R357W | 19 | 体重不增、电解质紊乱 |
| 4 | 男 | 10 | 669.0 | 239.5 | 9.7 | p.R357W | I2G | 10 | 皮肤色素沉着、电解质紊乱 |
| 5 | 男 | 14 | 740.0 | 65.8 | 7.5 | I2G | I2G | 14 | 呕吐、电解质紊乱 |
| 6 | 女 | 1月龄 | 353.0 | 328.3 | 1.7 | I2G | p.G111Vfs*21 | 1月龄 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 7 | 女 | 7 | 145.0 | 54.2 | 8.7 | I2G | I2G | 23 | 腹泻、电解质紊乱 |
| 8 | 男 | 20 | 316.0 | 89.0 | 0.5 | I2G | 大片段缺失 | 20 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 9 | 男 | 27 | 323.0 | 170.0 | 19.6 | 大片段缺失 | p.G111Vfs*21 | 27 | 体重不增、电解质紊乱 |
| 10 | 男 | 21 | 1 320.0 | 902.0 | 3.9 | I2G | 大片段缺失 | 21 | 呕吐、脱水、入量少、腹泻、反应差、电解质紊乱 |
| 11 | 男 | 24 | 953.0 | 422.0 | 11.2 | I2G | 大片段缺失 | 24 | 腹泻、电解质紊乱 |
| 12 | 男 | 7 | 562.5 | 522.0 | 8.4 | I2G | 大片段缺失 | 7 | 反应差、电解质紊乱 |
| 13 | 女 | 18 | 573.0 | 46.6 | 1.6 | 大片段缺失 | E6 Cluster | 18 | 电解质紊乱、代谢性酸中毒 |
| 14 | 男 | 13 | 522.0 | 58.3 | 4.2 | E6 Cluster | 大片段缺失 | 13 | 呕吐、拒奶、电解质紊乱 |
| 15 | 男 | 21 | 377.0 | 220.0 | 6.8 | I2G | 大片段缺失 | 21 | 喂养困难、呕吐、电解质紊乱 |
| 16 | 男 | 9 | 529.0 | 257.0 | 15.0 | 大片段缺失 | 大片段缺失 | 9 | 腹泻、脱水、休克 |
| 17 | 男 | 25 | 850.5 | 430.0 | 1.4 | 大片段缺失 | 大片段缺失 | 25 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 18 | 女 | 27 | 955.0 | 103.5 | 3.1 | 大片段缺失 | 大片段缺失 | 27 | 呕吐、食欲下降、易受惊、电解质紊乱 |
| 19 | 男 | 25 | 600.0 | 17.2 | 2.2 | I2G | p.Q319*－p.R357W | 25 | 呕吐、体重不增、乳晕和会阴色素沉着、电解质紊乱 |
| 20 | 女 | 2月龄 | 980.5 | 453.0 | 5.8 | I2G | p.L308Ffs*6－p.R357W | 2月龄 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 21 | 男 | 13 | 436.0 | 154.0 | 8.0 | I2G | I2G－p.T124I | 19 | 呕吐、腹泻、脱水、电解质紊乱 |
| 22 | 男 | 14 | 997.0 | 642.0 | 4.9 | p.H63L－p.G111Vfs*21－I2G | I2G | 14 | 呕吐、体重不增 |
| 23 | 男 | 14 | 75.7 | 1 106.0 | 4.8 | I2G | p.L308Ffs*6－p.R357W | 14 | 呕吐、体重不增、电解质紊乱 |
| 24 | 男 | 22 | 509.0 | 210.3 | 1.7 | p.Q319* | p.Q319*－p.R357W | 22 | 呕吐、电解质紊乱 |
| 25 | 男 | 21 | 137.0 | 51.1 | 0.9 | p.I173N | p.G111Vfs*21 | 21 | 腹泻、电解质紊乱 |
| 26 | 男 | 17 | 99.8 | 165.0 | 1.8 | p.R484P | p.G111Vfs*21 | 17 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 27 | 男 | 1月龄 | 420.0 | 312.0 | 2.5 | I2G | p.I173N | 22 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 28 | 女 | 18 | 157.0 | 9.0 | 2.2 | p.I173N | E6 Cluster | 18 | 呕吐、腹泻、电解质紊乱 |
| 29 | 男 | 5 | 659.3 | 30.8 | 4.0 | I2G | p.G111Vfs*21 | 5 | 电解质紊乱a |
| 30 | 女 | 1月龄 | 110.0 | 230.0 | 0.4 | p.R484Pfs*40 | 大片段缺失 | 1月龄 | 电解质紊乱a |
| 31 | 女 | 14 | 252.0 | 644.3 | 12.2 | p.Q319* | p.R357W | 14 | 电解质紊乱a |
| 32 | 男 | 13 | 637.0 | 332.2 | 8.8 | p.G111Vfs*21 | p.Q319* | 13 | 电解质紊乱a |
| 33 | 男 | 14 | 712.0 | 318.4 | 8.4 | 大片段缺失 | 大片段缺失 | 14 | 电解质紊乱a |
| 34 | 女 | 16 | 580.0 | 43.8 | 7.5 | I2G | 大片段缺失 | 16 | 电解质紊乱a |
| 35 | 男 | 18 | 389.0 | 171.2 | 1.3 | p.R357W | 大片段缺失 | 18 | 电解质紊乱a |
| 36 | 女 | 1月龄 | 428.0 | 37.9 | 2.2 | I2G | I2G | 1月龄 | 电解质紊乱a |
| 37 | 女 | 11 | 428.2 | 67.7 | 7.6 | p.Q319* | p.R357W | 11 | 电解质紊乱a |
| 38 | 男 | 1月龄 | 605.0 | 122.3 | 10.8 | p.M486Wfs*56 | p.G111Vfs*21 | 1月龄 | 电解质紊乱a |
| 39 | 女 | 38 | 177.0 | 19.1 | 1.7 | p.R357W | 大片段缺失 | 38 | 电解质紊乱a |
| 40 | 男 | 7 | 1 020.0 | 573.0 | 3.9 | 大片段缺失 | p.Q319* | 7 | 电解质紊乱a |
| 41 | 男 | 27 | 654.0 | 29.9 | 7.4 | p.R357W | p.R92G | 27 | 电解质紊乱a |
| 42 | 男 | 4月龄 | 622.0 | 33.6 | 1.1 | I2G | I2G | － | － |
| 43 | 女 | 15 | 800.0 | 476.0 | 2.3 | p.G111Vfs*21 | I2G | － | － |
| 44 | 男 | 3月龄 | 193.0 | 785.0 | 2.8 | I2G | I2G | － | － |
| 45 | 女 | 1月龄 | 365.0 | 413.2 | 2.4 | p.R357W | p.R357W | － | － |
| 46 | 女 | 15 | 760.0 | 576.0 | 3.2 | I2G | I2G | － | － |
| 47 | 女 | 15 | 400.0 | 217.0 | 1.7 | I2G | p.Q319* | － | － |
| 例序 | 性别 | 就诊年龄(d) | 治疗前生化检测结果 | 基因检测结果 | 发生危象年龄(d) | 危象表现 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 17－OHP | ACTH | 睾酮 | 等位基因1(母源性) | 等位基因2(父源性) | |||||
| 48 | 男 | 20 | 290.0 | 1250.0 | 15.0 | p.Q319*－p.R357W | I2G | － | － |
| 49 | 女 | 15 | 115.0 | 91.6 | 0.4 | I2G | p.Q319*－p.R357W | － | － |
| 50 | 男 | 12 | 132.0 | 190.3 | 4.1 | I2G | 大片段缺失 | － | － |
| 51 | 男 | 40 | 387.0 | 100.0 | 4.8 | 大片段缺失 | I2G | － | － |
| 52 | 女 | 1月龄 | 604.0 | 73.8 | 8.9 | I2G | p.I173N | － | － |
| 53 | 男 | 2月龄 | 137.0 | 48.3 | 0.8 | I2G | p.I173N | － | － |
| 54 | 男 | 1月龄 | 177.0 | 22.3 | 2.1 | p.I173N | p.G111Vfs*21 | － | － |
| 55 | 男 | 5月龄 | 337.0 | 150.1 | 3.1 | I2G | p.I173N | － | － |
| 56 | 男 | 2月龄 | 223.0 | 35.0 | 2.9 | p.I173N | p.M486Wfs*56 | － | － |
| 57 | 女 | 40 | 193.0 | 785.0 | 2.8 | p.R484W | I2G | － | － |
| 58 | 女 | 15 | 194.0 | 93.2 | 0.6 | p.I173N | p.M486Wfs*56 | － | － |
| 59 | 男 | 1月龄 | 428.0 | 199.0 | 0.9 | p.I173N | p.Q319* | － | － |
| 60 | 女 | 1月龄 | 300.0 | 238.2 | 5.4 | p.I173N | p.L308Ffs*6 | － | － |
| 61 | 男 | 45 | 187.0 | 73.3 | 0.8 | p.I173N | p.I173N | － | － |
| 62 | 女 | 1月龄 | 338.6 | 156.0 | 0.4 | p.I173N | p.I173N | － | － |
| 63 | 女 | 1月龄 | 112.0 | 123.1 | 0.9 | p.I173N | p.I173N | － | － |
| 64 | 男 | 20 | 197.0 | 210.0 | 2.3 | p.I173N | 大片段缺失 | － | － |
| 65 | 男 | 40 | 202.0 | 187.6 | 3.0 | p.I173N | p.I173N－p.R436C | － | － |
| 66 | 男 | 3月龄 | 129.0 | 48.7 | 2.8 | p.V282L | p.V282L－p.I173N－E6 Cluster－p.L308Ffs*6 | － | － |
注：临床分型：例1～41为失盐型，例42～66未能分型；E6 Cluster：包含p.I237N、p.V238E和p.M240K 3个位点突变；17－OHP：17－羟孕酮，单位为nmol/L；ACTH：促肾上腺皮质激素，单位为ng/L；睾酮单位为μg/L；a指患儿初诊前未出现过呕吐、腹泻、体重不增、脱水等症状，但初诊行生化检测提示已出现低血钠、高血钾的电解质紊乱；"－"示未发生肾上腺皮质功能危象
确诊的66例患儿(132个等位基因)在CYP21A2基因上均有两个等位基因的突变。经Sanger测序和MLPA技术检测，在24个(18.2%)等位基因上检测到了大片段缺失，在10个等位基因上检测到2个或2个以上点突变(7.6%)，另在98个等位基因上共检测出13种点突变(74.2%)，包括8种错义突变(p.I173N、p.R484P、p.R357W、p.R484W、p.V282L、p.R92G、p.R436C、E6 Cluster)、1种无义突变(p.Q319*)、3种缺失突变(p.R484Pfs*40、p.G111Vfs*21和p.M486Wfs*56)和1种剪接位点突变(I2G)。在所有患儿CYP21A2基因上发现的点突变和大片段缺失的频率结果见表2。
 | 表2 66例21－羟化酶缺乏症患儿突变的基因型和频率分布 |
66例21－羟化酶缺乏症患儿突变的基因型和频率分布
| 突变碱基改变 | 突变蛋白改变 | 突变类型 | 纯合子例数 | 杂合子例数 | 频数 | 频率(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| c.293－13A/C>G | I2G | 剪接位点突变 | 6 | 28 | 40 | 30.3 |
| c.518T>A | p.I173N | 错义突变 | 3 | 13 | 19 | 14.4 |
| c.1069C>T | p.R357W | 错义突变 | 1 | 9 | 11 | 8.3 |
| c.332_339del | p.G111Vfs*21 | 缺失突变 | 0 | 9 | 9 | 6.8 |
| c.955C>T | p.Q319* | 无义突变 | 0 | 7 | 7 | 5.3 |
| c.1454del | p.M486Wfs*56 | 缺失突变 | 0 | 3 | 3 | 2.3 |
| c.710T>A；c.713T>A; c．719T>A | E6Cluster(p.I237N；p.V238E；p.M240K) | 错义突变 | 0 | 3 | 3 | 2.3 |
| c.1451G>C | p.R484P | 错义突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.1450dup | p.R484Pfs*40 | 缺失突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.1450C>T | p.R484W | 错义突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.844G>T | p.V282L | 错义突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.274A>G | p.R92G | 错义突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.923dup | p.L308Ffs*6 | 插入突变 | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.955C>T－c.1069C>T | p.Q319*－p.R357W | Clustera | 0 | 4 | 4 | 3.0 |
| c.923dup－c.1069C>T | p.L308Ffs*6－p.R357W | Cluster | 0 | 2 | 2 | 1.5 |
| c.188A>T－c.332_339del－c.293－13A/C>G | p.H63L－p.G111Vfs*21－I2G | Cluster | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.293－13A/C>G－c.371C>T | I2G－p.T124I | Cluster | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.518T>A－c.1306C>T | p.I173N－p.R436C | Cluster | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| c.844G>T－c.518T>A－(c.710T>A/c.713T>A＋c.719T>A)－c.923dup | p.V282L－p.I173N－E6 Cluster－p.L308Ffs*6 | Cluster | 0 | 1 | 1 | 0.8 |
| 大片段缺失 | 0 | 24 | 24 | 18.2 | ||
| 合计 | 10 | 112 | 132 | 100.0 |
注：aCluster指在一个等位基因上同时携带有2个或2个以上点突变
在66例患儿中10例(15.2%)携带纯合突变，包括I2G 6例、p.I173N 3例和p.R357W 1例，余56例(84.8%)携带复合杂合突变，其中36例复合杂合突变均为点突变，16例同时携带点突变和大片段缺失，4例则在2个等位基因上均携带大片段缺失。每例患儿携带的基因型结果见表1。经父母源性验证所有患儿2个突变均分别遗传自父方或母方，符合常染色体隐性遗传方式。
在41例上述经临床表现和生化检查归类为21－OHD失盐型的患儿中，34例患儿携带的基因型均属于A组或B组的基因型。例21和例22患儿的基因型分别为I2G/I2G－p.T124I和I2G / p．H63L－p.G111Vfs*21－I2G，虽均携带了一个未知功能的突变(p.T124I和p.H63L)，但在相同等位基因上均携带了可致酶活性完全丧失或仅剩极低活性的突变，故将这2例患儿基因型均归类为B组。以上36例患儿按其基因型可预测为SW型，与其实际的临床表型一致(87.8%)。另4例患儿(例25～例28)携带的基因型均属于C组的基因型，预测为SV型，与其实际的失盐表型不一致(9.8%)，而例41的患儿因在其中一个等位基因上仅携带一个未知功能的突变p.R92G，故未能对其进行相关表型的预测。此外，在25例未能经临床表现和生化检查确定临床表型的患儿中，10例携带的基因型属于A组或B组的基因型，余15例携带的基因型归类为C组、D组或E组。
本课题组前期已通过生化检测指标等对CAH早期诊断患者的表型及预后情况进行探讨[14]，本次主要结合表型进行基因型的相关性分析。首先对纳入的66例患儿进行临床资料的分析，发现虽然所有患儿由新生儿筛查检出，但患儿的初诊时间仍有一定的延后。其中42例患儿于1月内(4～27 d)就诊并治疗，余24例就诊年龄均达到或超过1月龄，最晚1例为5月龄，这可能与部分家庭条件限制、部分家长未予以足够重视，在接到召回通知后未即刻至医院就诊，或者与新生儿筛查中心未充分告知有关。我们注意到66例中41例症状或化验结果提示了失盐的现象，发生年龄除2例患儿分别在2月龄和38 d外，余年龄均小于1月龄，最早的患儿仅出生4 d时即出现肾上腺皮质功能危象表现。而据报道，失盐型患儿出现肾上腺皮质功能危象的时间多在生后1～4周内[15]，可见新生儿筛查发现17－OHP异常升高后应及早召回复查，并密切追踪保证所有患儿尽快回访，且在确诊后立即开始治疗，以避免肾上腺皮质功能危象的发生。例7和例21的患儿虽均在11 d以内开始早期治疗，但因出现感染等应激状态，使治疗的皮质醇剂量不足而导致出现肾上腺皮质功能危象，经调整皮质醇剂量后病情才得到较好地控制。因此，即使在早期治疗过程中，当患儿出现应激状态时，应及时增加皮质醇治疗剂量，尽快控制代谢紊乱。
本组66例均为CYP21A2基因的缺陷，其突变频率和基因型不能完全体现中国人群21－OHD患儿的突变谱情况，但可一定程度地反映21－OHD的基因突变特点。我们在74.2%的等位基因上发现了点突变，共13种点突变类型，其中最常见的为I2G、p.I173N、p.R357W、p.G111Vfs*21和p.Q319*，这5个突变共占65.2%的比率，另18.2%的等位基因上发现了大片段缺失及7.6%等位基因上发现了携带2个或2个以上的点突变。以上所获得的热点突变及频率与中国人群[16,17,18,19]及其他人群[20,21,22,23]报道比较基本相似。
如前所述，除去未能经临床表现和生化检查判定临床表型的25例患儿，本课题组对41例21－OHD失盐型表型的患儿进行了基因型和表型的相关性分析，根据患儿携带的CYP21A2基因2个等位基因上突变所报道的对编码酶活性影响程度判定患儿可能的表型。在36例患儿中发现携带的2个突变均经功能研究证实可引起21－羟化酶活性基本完全丧失，故可预测其可引起较严重的表型，与患儿21－OHD失盐型表型相符率较高(87.8%)。但仍有9.7%的患儿携带有1个经报道仅引起21－羟化酶部分丧失活性及1例(2.4%)患儿携带1个对21－羟化酶活性影响不确定的突变，这些患儿也表现出21－OHD失盐型的表型。在余下25例未能明确表型的患儿中，有10例携带文献报道的可引起编码酶完全失活性的2个突变，但在治疗前和随访中未出现失盐的表现，特别是其中有6例患儿在12～20 d即开始治疗，患儿可能因早期治疗，纠正了代谢异常，避免了临床症状(特别是肾上腺皮质功能危象)的显现。由此可见，通过对新生儿筛查阳性患儿的确诊、早期治疗和基因型的分析，可以帮助临床医师对21－OHD患儿及时干预，避免临床症状的发生，达到疾病预防的目的。因此，对于早期治疗的患儿，经纠正其生化代谢异常，可不出现临床症状，或肾上腺皮质功能危象，基因型的确定在一定程度上可协助新生儿筛查患儿的临床表型预测，为临床诊疗提供更好的信息。
综上所述，本组66例21－OHD患儿虽均经新生儿筛查检出，但就诊或者治疗年龄有不同程度的延后，致41例患儿出现了肾上腺皮质功能危象的表现。对CYP21A2基因的部分突变谱的揭示有助于进一步的遗传咨询和产前诊断，在本组21－OHD失盐型患儿中大多数基因型与表型相关，但仍有少数存在不一致。对于早期治疗的新生儿筛查患儿，依据基因型进行表型(SW、SV)判断有一定参考意义。
探讨经新生儿筛查发现并确诊的21羟化酶缺乏症(21－OHD)患儿的临床表型与基因型的相关性及基因突变频率特点。
回顾分析2009—2014年经新生儿筛查发现并经上海交通大学医学院附属新华医院儿科内分泌/遗传科、新生儿筛查中心确诊的66例21－OHD患儿的临床和生化资料。采用Sanger测序和多重连接探针扩增技术，对CYP21A2基因外显子区域检测点突变和大片段缺失，分析临床表型与基因型的相关性。
(1)66例患儿中41例(62%)在4 d ～2月龄时出现了肾上腺皮质功能危象或其他失盐表现，归类为21－OHD失盐型，余25例就诊时(12 d～2月龄)未出现任何失盐的表现。(2)66例患儿(132个等位基因)CYP21A2基因上均检测到两个等位基因的突变，共发现了13种不同的点突变(98/132，74.2%)、大片段缺失(24/132，18.2%)和同一等位基因上2个或2个以上的点突变(10/132，7.6%)。其中最多见的点突变依次为I2G、p.I173N、 p．R357W、p.G111Vfs*21和p.Q319*，突变频率合计占65.2%。(3)对41例21－OHD失盐型患儿行表型和基因型相关性分析，36例(87.8%)患儿依据其基因型预测的表型与实际的失盐表型一致，而4例预测的表型与实际表型不一致， 1例因携带一个等位基因上的未知功能突变，未能根据基因型进行表型的预测。
62%的21－OHD患儿生后4 d～2月龄时出现肾上腺皮质功能危象或其他失盐表现。66例中国21－OHD患儿CYP21A2基因突变中，I2G、p.I173N、 p．R357W、p.G111Vfs*21和p.Q319*突变频率合计占65.2%。失盐型患儿87.8%基因型预测表型与实际表型相一致。