颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）盘是颞下颌关节的重要结构之一，具有吸收关节受到的冲击力、减轻负荷、协调关节稳定性等作用。TMJ关节盘主要由细胞和细胞外基质组成。TMJ关节盘细胞为纤维软骨细胞，根据细胞形态分为成纤维细胞样细胞和软骨细胞样细胞。细胞外基质主要由胶原和蛋白多糖组成，以Ⅰ型胶原为主，也可见一定量的Ⅱ型胶原及少量弹性纤维。关节盘穿孔是发生于晚期的严重TMJ紊乱病，常因TMJ疼痛、下颌运动功能障碍等严重影响患者的日常生活。发生穿孔的关节盘不能重新愈合，目前临床治疗手段尚不能达到理想的治疗效果。

作为关节盘的重要组成部分，TMJ关节盘细胞具有维持细胞外基质合成和降解动态平衡的功能。TMJ关节盘退行性变的组织学改变为胶原纤维玻璃样变，溶解断裂并形成裂隙，严重时可引起关节盘穿孔。但TMJ关节盘穿孔发生过程中关节盘细胞合成Ⅰ型胶原的能力是否发生变化尚不清楚。本项研究通过对未发生TMJ关节盘穿孔和关节盘穿孔两组患者的颞下颌关节盘细胞进行培养，比较观察两种来源的TMJ关节盘细胞在体外培养环境下合成Ⅰ型胶原能力的差异，以期探讨关节盘细胞在TMJ关节盘穿孔病变中的功能改变及其在TMJ关节盘穿孔发生中的作用。

本研究为随机对照实验性研究（研究时间为2015年3月至2016年7月），研究经武汉大学口腔医学院人体试验研究伦理委员会的批准（批准号：2014-024），所有患者均签署了知情同意书。

医用净化工作台，电热恒温水浴箱，CO₂孵箱；Ⅱ型胶原酶购自Gibco公司（美国），达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM），胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，）均购自美国Hyclone公司。

研究分穿孔组和对照组，细胞培养的组织均来源于在武汉大学口腔医学院行TMJ关节手术时因治疗需要切除的标本。对照组的组织块取自下颌骨髁突肥大接受手术的患者，术中需切除外侧部分关节盘组织以保持合适的盘突大小（本组患者2例，男、女各1例，年龄分别为22、25岁）。穿孔组的组织块取自TMJ关节盘穿孔修补术患者，术中需切除穿孔的边缘组织形成新鲜创面以便缝合修补关节盘（本组患者5例，均为女性，年龄21~42岁，平均24.4岁）。手术切除的组织块大小为2 mm ×5 mm。组织块用含1×10⁸ U/L青霉素+10 000 mg/L链霉素的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）充分洗涤3~4次，在培养皿内剪碎成1 mm ×1 mm大小的碎块。将剪碎的组织块在2 ml含0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液中37 ℃消化30 min。1 200 r/min离心5 min（离心半径6 cm），去除上清液，加含双抗的DMEM+Ⅱ型胶原酶（3 g/L），置于37 ℃含5% CO₂孵箱消化3 h。轻吹打散细胞团块，将消化物用含20%的DMEM培养液按1∶8稀释重悬后，移至T25培养瓶，于5%CO₂饱和湿度37 ℃培养，每3天换液l次。倒置显微镜下观察细胞生长情况。

将第1代细胞爬片置于4%多聚甲醛固定15 min，自来水轻柔漂洗15 min，蒸馏水洗5 min后加1%甲苯胺蓝浸染2 min，滤纸上吸尽多余液体，浸泡于90%乙醇10 s，显微镜下观察染色情况。观察染色满意后晾干，中性树胶封片。

第1代细胞爬片细胞生长至70%融合时，倒掉培养基，4%多聚甲醛固定10 min后免疫荧光染色，封片后荧光显微镜下观察拍片。

在细胞传第1代后，细胞生长至70%~80%时，换1%胎牛血清的培养基培养48 h后收集上清液，ELISA试剂盒检测Ⅰ型胶原含量（参照试剂盒说明）。

培养收集各组第1代细胞，分别提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度。调整各标本蛋白浓度为1.5 g/L，各组标本取20 μl进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），转膜；结束后放入封闭液中，温和振荡2 h（4 ℃），放入1∶1 000稀释的Ⅰ型胶原一抗中，4 ℃过夜，回收一抗，洗膜3次，每次10 min，加入二抗，常温孵育1 h后封闭、显影，扫描胶片。

采用SPSS 11.0统计软件对结果数据进行统计学分析。所有数据经单样本Kolmogorov-Smirnov检验及方差齐性检验，采用非配对t检验对ELISA的结果数据进行统计学分析，以单侧P<0.05为差异有统计学意义。

倒置显微镜下观察，关节盘细胞呈短柱状，也有少量细胞呈长梭型，细胞长满时可呈现镶嵌状类似铺路石样（图1A）。甲苯胺蓝染色显示关节盘细胞呈阳性表达（图1B）。

细胞Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫荧光染色显示，对照组及穿孔组培养的细胞均同时表达阳性（图2）。

培养48 h的第1代细胞上清液中，对照组Ⅰ型胶原的含量为（1.62±0.52）?g/L，穿孔组为（0.85±0.33）?g/L，对照组显著高于穿孔组（P=0.0134）。

比较培养48 h的第1代细胞，对照组Ⅰ型胶原蛋白表达高于穿孔组（图3）。

TMJ关节盘是一种黏弹性物质——纤维软骨样组织，主要由水、关节盘细胞和细胞外基质组成。TMJ关节盘细胞为纤维软骨细胞，根据细胞形态分为成纤维细胞样细胞和软骨细胞样细胞，成纤维细胞样细胞呈梭形，软骨细胞样细胞呈卵圆形。成纤维细胞样细胞周边主要分布Ⅰ型胶原，软骨细胞样细胞周边主要分布Ⅱ型胶原。研究显示，关节盘细胞的形态随着年龄或功能状态不同而呈纤维细胞样和软骨细胞样^[1]，其细胞外基质成分也发生相应改变。本研究中培养的细胞呈长条索样，甲苯胺蓝染色及Ⅰ型胶原染色均呈阳性，证明其为成纤维细胞样细胞。

TMJ关节盘细胞外基质主要由胶原和蛋白多糖组成^[2]，其中Ⅰ型胶原大约占关节盘湿质量分数的30%，干重的68.2%，另外也可见一定量的Ⅱ型胶原及少量弹性纤维成分^[3]。不可复性关节盘前移位后早期表现为胶原纤维排列紊乱，继续发展到晚期出现胶原纤维断裂、弹力纤维溶解，从而出现关节盘破裂、穿孔。Leonardi等^[4]在TMJ关节盘前移位中通过组织化学方法观察到胶原纤维排列紊乱、断裂以及关节盘细胞表型的改变。

TMJ关节盘细胞的分离培养本世纪初才开始，其细胞力学方面的研究尤其少。Miyako等^[5]研究发现，TMJ关节盘细胞的表型与出生后发育过程中关节内承受的力等有关。目前对TMJ关节盘穿孔的病因尚不肯定，临床观察发现TMJ关节盘穿孔多发于关节盘的后带与双板区交界处。这提示关节盘穿孔与TMJ关节盘的生物力学特性有关^[6]。研究发现应力负荷能改变关节盘细胞合成分泌细胞外基质，并且不同的应力负荷产生的影响也不同。在静水压对关节盘单层细胞影响的试验中发现，同样是10 MPa的静水压，持续和间断施压即可对细胞外Ⅰ型胶原合成的能力产生影响^[7]。为尽可能减少体外培养过程中关节盘细胞合成Ⅰ型胶原能力发生改变的可能，本研究选择第1代培养的TMJ关节盘细胞进行观察。结果显示，穿孔的关节盘细胞合成Ⅰ型胶原的能力较对照组显著降低。这是由于发生关节盘穿孔的关节盘细胞由于长期受到异常负荷，其合成、分泌Ⅰ型胶原的能力降低，从而导致关节盘内穿孔处的Ⅰ型胶原含量减少，关节盘变薄。

研究发现，在正常的关节盘中成纤维样细胞多见，而在移位的关节盘中软骨样细胞多见^[8,9]。在穿孔的关节盘中常伴有软骨细胞样细胞增殖，这种变化被认为是关节盘修复能力降低的原因。在关节盘细胞外形及合成胶原能力发生改变的同时，关节盘细胞外基质因受到异常负荷，关节盘外形发生应变。研究发现，关节盘在2%~4%的应变下能保持结构正常，超过6%的应变即可产生中、后带局部胶原纤维横向拉伸剪切破坏。拉伸实验也表明，在同样应变下中带和后带胶原纤维较前带更易破坏。前移位的关节盘在上述因素的共同作用下最终可引起关节盘穿孔，这与临床发现关节盘穿孔的多发部位一致。

尽管本研究发现关节盘穿孔组的细胞表达Ⅰ型胶原的能力降低，但其降低是否与关节盘所受到的异常负荷有关，是何种异常负荷引起等，尚需进一步观察。