干细胞是一类具有自我复制及多向分化潜能的细胞。研究证实，在造血干细胞及间充质干细胞中均存在具有不同分化潜能的干细胞，单细胞分析技术也证实一些蛋白的表达局限于特定的细胞亚群^[1,2]。不同类型的细胞间存在细胞交流从而维持功能的协调。细胞间的交流可通过受体介导的途径，也可以通过微囊泡的形式转运膜受体、蛋白、mRNA及微小RNA等形式^[3,4]。牙周膜干细胞作为一种间充质干细胞，具有向成骨、成脂及成软骨等方向分化的能力^[5,6]。牙周膜干细胞较其他干细胞具有更好的克隆形成能力和增殖能力，是研究细胞异质性以及异质性细胞间交流的理想细胞。

组蛋白乙酰化是组蛋白赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，组蛋白乙酰转移酶在其中起重要作用^[7]。本实验旨在研究正常牙周膜来源的单克隆细胞成骨方面的差异，探究成骨分化能力不同的单克隆细胞间是否存在细胞交流从而影响细胞成骨，初步探索组蛋白乙酰转移酶在细胞交流中的作用。

本项研究（2015年6月至2016年9月）经第四军医大学口腔医学院伦理委员会批准（批准号：IRB.REV.2015005），所有受试者均签署了知情同意书。

α-最低必需培养基（α-minimum essential medium，α-MEM）（Glibco BRL，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；左旋谷氨酰胺、链霉素、青霉素（Invitrogen，美国），Ⅰ型胶原酶、多聚甲醛、β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松、十六烷基硫酸钠（Sigma，美国）；胰蛋白酶（Amresco，美国）；茜素红（Sigma，美国）；实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）试剂盒（Takara，日本）；乙酰化组蛋白H3抗体（acetyl-histone H3，Millipore，美国）；1.0 μm孔径6孔板用Transwell（Millipore，美国）；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠单克隆抗体（北京康为世纪生物科技有限公司）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（西安壮志生物科技有限公司）；CD29-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、CD31-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、CD90-PE、CD146-PE（eBioscience，美国），CD34-PE、CD105-PE（Biolegend，美国）；蛋白质印迹法及细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）；6孔培养板、75 cm²培养瓶（Falcon，美国）。二氧化碳恒温培养箱、酶联免疫检测仪（Thermo，美国）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）；紫外线分光光度仪（Ependorf，德国）；CFX96 Real Time System蛋白电泳仪（BioRad，美国）。

实验牙均为第三磨牙，来源于第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科。离体牙入选标准：患者无系统性疾病、20~30岁因正畸拔牙、无牙周炎。离体牙拔除后即刻于超净工作台用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）冲洗3次，无菌条件下刮取根中1/3区域牙周膜组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，800×g离心5 min，去上清液，加入Ⅰ型胶原酶2 ml，置37 ℃培养箱内消化60 min；800×g离心5 min，去上清液，用10%胎牛血清的α-MEM重悬细胞，接种于6孔培养板，待细胞生长汇合达30%时进行有限稀释，以5个/ml的密度接种于96孔板，第2天进行显微镜下观察，去除无细胞及≥2个以上贴壁细胞的孔，连续观察3 d，确保96孔内只有单个细胞。每隔5天换液，待细胞长满96孔后，传代至6孔板，待长满后传至培养瓶中，扩大培养。本实验所用牙周膜细胞为第4~6代细胞。

取第4代牙周膜单克隆细胞，以2×10⁵个/ml接种于6孔板中，待细胞长至80%~90%时，换为成骨诱导液（地塞米松100 nmol/L、10%胎牛血清的α-MEM、维生素C 50 mg/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L），每隔2天换液，28 d后行成骨染色，10%氯化十六烷基吡啶在酶联免疫检测仪540 nm处检测吸光度值（A值）。

取第4代牙周膜单克隆细胞，以2×10⁵个/ml接种于6孔板中，待细胞长至80%~90%时换成脂诱导液培养14 d，每3天更换成脂诱导液。第14天行油红O染色，吸弃细胞培养液，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定30 min；去除多聚甲醛固定液，PBS冲洗3次，加入油红O染色液，37 ℃孵育30 min；吸弃油红O染色液，PBS冲洗2次，显微镜下拍照。

取第4代牙周膜单克隆细胞，胰酶消化，培养液中和后800×g离心5 min，PBS重悬后计数，细胞密度为1×10⁶个/ml，分装至1.5 ml EP管中。分别加入FITC、PE标记的抗人CD29-FITC、CD31-PE、CD90-PE、CD146-PE、CD34-PE及CD105-FITC，对照组不加。4 ℃避光孵育30 min，800×g离心5 min，弃上清液，PBS洗2次，200 μl PBS重悬，上流式细胞仪检测。

Trizol试剂盒提取RNA，用qPCR试剂盒反转录合成cDNA，反应体系（SYBR Premix EX Taq^TMⅡ 5 μl、ddH₂O 3.2 μl、上下游引物各0.4 μl、样本模板1 μl），引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，GAPDH为内参（表1）。

加入细胞裂解液提取总蛋白；行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜（≥8 h）；含吐温20的Tris-HCl缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）洗10 min×3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗10 min×3次，凝胶成像仪成像，以GAPDH为内参。实验重复3次。

将具有一定成骨分化能力的牙周膜单克隆细胞以2×10⁵个/ml接种于6孔板，根据碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素红染色及定量结果判断单克隆细胞的成骨强弱，并将同一个体来源成骨强弱不同的细胞以2×10⁵个/ml种于Transwell小室，Transwell接种成骨能力弱的单克隆细胞为成骨弱组，成骨能力强者为成骨强组，设置空白对照组，每组3个复孔，共培养4 d后移除Transwell小室，行成骨诱导。7 d后检测成骨相关基因，28 d后茜素红染色。间接共培养4 d后检测底层细胞乙酰化的组蛋白H3蛋白表达，qPCR检测组蛋白乙酰转移酶表达。上述实验各组底层所用细胞均为同种细胞，所有细胞均为同一个体来源。

所有实验均以3个不同个体来源的单克隆细胞进行重复，采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析，两两比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计量资料采用均数±标准差表示，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

见图1。

（1）倒置相差显微镜观察：牙周膜单克隆细胞呈典型的长梭形（图1A）。

（2）流式细胞术鉴定：牙周膜单克隆细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD90、CD105和CD146，表达率分别为（99.80±0.02）%、（99.36±0.18）%、（99.41±0.05）%和（95.10±2.11）%；阴性表达CD31和CD34，表达率分别为（0.29±0.11）%和（0.22±0.13）%。

（3）成骨分化：牙周膜单克隆细胞成骨分化诱导28 d后，镜下可见钙化结节（图1B）。

（4）成脂分化：牙周膜单克隆细胞成脂分化诱导14 d后，镜下可见脂滴形成（图1C）。

见图2。ALP及茜素红染色定量结果显示，同一个体的牙周膜单克隆细胞SC1~SC6的A值分别为0.25±0.02、0.27±0.01、0.50±0.05、2.08±0.05、1.85±0.05及2.92±0.08，结果显示同一个体不同单克隆细胞间存在成骨能力较强以及较弱的单克隆细胞。

见图3。PCR结果显示成骨强组相比于空白对照组以及成骨弱组，其对下层细胞的成骨分化具有更强的促进作用（表2）。空白对照组、成骨弱组、成骨强组茜素红定量结果分别为1.49±0.13、2.14±0.04和2.73±0.10，两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

A：组蛋白H3；B：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；C1、C2、C3：空白对照组牙周膜单克隆细胞；W1、W2、W3：成骨弱组牙周膜单克隆细胞；S1、S2、S3：成骨强组牙周膜单克隆细胞

见图4。蛋白质印迹法及灰度值定量结果显示，成骨强组下层细胞组蛋白H3乙酰化水平（0.76±0.09）显著高于成骨弱组（0.54±0.12）和空白对照组（0.30±0.04）（P<0.05），成骨弱组显著高于空白对照组（P<0.05）。

C1、C2、C3：空白对照组牙周膜单克隆细胞；W1、W2、W3：成骨弱组牙周膜单克隆细胞；S1、S2、S3：成骨强组牙周膜单克隆细胞

见表3。qPCR结果显示，在众多组蛋白乙酰转移酶中，KAT6A表达的变化趋势最明显，且与底层细胞组蛋白H3的乙酰化改变趋势相同。

间充质干细胞中存在不同亚群，可表达促血管生成、免疫调控等调节蛋白^[8]，此种多样性对组织的稳态及间充质干细胞的基础和临床应用具有重要意义。干细胞间可通过自分泌以及旁分泌的形式分泌相关蛋白及mRNA^[9,10]，从而调节微环境并介导细胞间的信息交流。牙周膜干细胞作为一种间充质干细胞，具有很强的克隆形成和增殖能力，考虑到牙周膜干细胞具有成骨分化能力，因此，本实验主要着力于研究牙周膜单克隆细胞成骨的异质性，探索成骨能力存在差异的单克隆细胞间是否存在细胞交流从而影响细胞的成骨分化潜能。

本实验通过比较单克隆细胞成骨相关的ALP和茜素红染色初步证实单克隆细胞间存在成骨分化差异性，提示牙周膜单克隆细胞中存在成骨分化能力具有差异的不同亚群。为进一步研究这些亚群细胞是否存在细胞交流从而影响相互成骨，本研究采用间接共培养的方法，qPCR及茜素红染色结果显示成骨弱和强的单克隆细胞都能促进其他单克隆细胞的成骨能力，成骨强的单克隆细胞具有更强的促成骨能力。推测成骨强的单克隆细胞通过分泌mRNA、微小RNA等物质改变细胞所处的微环境，从而影响靶细胞的成骨分化能力。

组蛋白乙酰化水平与细胞分化息息相关^[11]。组蛋白H3的高乙酰化介导了细胞成骨分化^[12,13]。因此，在成骨分化能力不同的亚群细胞间接共培养过程中，组蛋白H3乙酰化水平的改变很可能参与了细胞成骨分化能力的改变。

本实验证实在间接共培养过程中，成骨强与成骨弱组底层细胞组蛋白H3乙酰化水平升高，提示组蛋白乙酰化水平的改变可能参与此种细胞交流，通过qPCR筛选组蛋白乙酰转移酶，发现底层细胞的KAT6A发生明显改变，表达趋势为成骨强组>成骨弱组>空白对照组，这与组蛋白H3乙酰化水平的改变趋势相符，提示成骨强组牙周膜单克隆细胞可能通过细胞交流途径介导底层细胞KAT6A的表达变化，从而改变组蛋白乙酰化水平。

综上，本实验发现牙周膜单克隆细胞中成骨能力存在差异，成骨能力强的单克隆细胞具有更强的促成骨分化能力，组蛋白乙酰化水平的改变参与此过程，KAT6A的表达改变与组蛋白乙酰化水平的改变相符，提示KAT6A很有可能在组蛋白乙酰化水平的改变中起重要作用。本研究证实分化能力存在差异的亚群细胞间存在细胞信息交流从而改变其他亚群细胞的分化能力，干细胞是由不同亚群细胞组成的群落，亚群间的信息交流对维持群落功能及稳态至关重要，对细胞亚群间信息交流的了解将有助于更深入了解干细胞的复杂性，使干细胞能更好地应用于临床。