大量研究已证实，经典Wnt/β-联蛋白通路参与调控哺乳动物的牙齿发育^[1,2]。果蝇裸露角质蛋白（naked cuticle，Nkd）的哺乳动物同源物Nkd2，是Wnt/β-联蛋白通路的下游靶基因，Wnt通路中T细胞因子（T cell factor，TCF）与Nkd基因序列中的Wg反应元件新位点结合，激活Nkd2的转录翻译^[3]。Nkd2通过蓬乱蛋白1负向调节Wnt/β-联蛋白信号通路^[4,5]。研究认为Nkd2作为可诱导抑制剂，可负反馈调节Wnt/β-联蛋白通路，维持个体发育中Wnt信号通路的平衡。

本课题组前期研究发现，经典Wnt/β-联蛋白信号通路促进大鼠牙囊细胞（dental follicle cells of rat，rDFC）的成骨/成牙骨质向分化^[6]。基因芯片检测发现rDFC矿化诱导4周后Nkd2 mRNA表达较对照组显著下调，提示Nkd2可能参与rDFC的成骨/成牙骨质向分化。因此，本实验旨在探讨以下3个问题：①大鼠牙根形成过程中Nkd2在牙囊组织中是否存在时空表达差异；②rDFC矿化诱导前后Nkd2表达是否变化及其与成骨因子的关系；③小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）瞬时沉默rDFC中的Nkd2，矿化诱导1周后成骨相关因子的表达情况。本实验通过研究Nkd2对牙囊成骨向分化的具体作用，完善Wnt通路在牙发育中的作用机制，以期为牙再生提供实验基础。

本项研究时间为2015年11月至2016年12月，研究获得中山大学动物伦理委员会审批（批准号：IACUC-BD-16-0402）。

取出生后1、3、5、7、9、11及13 d Sprague-Dawley（SD）大鼠（中山大学实验动物中心购买，动物合格证号：44008500014137）经石蜡包埋的下颌骨切片，取相同位置的3张连续切片分别行HE染色，Nkd2免疫组化检测Nkd2在大鼠下颌第一磨牙牙胚近基底侧牙囊组织中的表达（羊抗鼠Nkd2抗体，Santa Cruz，美国），辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗（Earth，美国）和阴性对照（磷酸盐缓冲液代替一抗）。

取出生后5~7 d的SD乳鼠下颌第一、二磨牙牙囊，于含20%胎牛血清（Gibco，美国）及2%双抗（Sigma-Aldrich，美国）的α-最小必需培养基（α-minimum essential medium，α-MEN，Gibco，美国）的T25培养瓶中（Corning，美国），37 ℃、5%CO₂条件下培养，胰蛋白酶差速消化法传代。第3代rDFC经波形丝蛋白、角蛋白抗体（武汉博士德技术有限公司）染色鉴定细胞来源，大鼠骨髓间充质干细胞染色波形丝蛋白为阳性对照，人舌癌细胞系（squamous cell carcinoma 25，SCC25）染色角蛋白为阳性对照。取生长状态良好的第3~5代细胞以10⁵个/ml接种于6孔板（Corning，美国），24 h后加含50 g/L抗坏血酸、10^-8 mol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸钠（Sigma-Aldrich，美国）的10%胎牛血清α-MEM矿化诱导液，每3天换液1次。10%胎牛血清α-MEM培养的细胞为对照组。矿化诱导1、2、3周，4%多聚甲醛固定后茜素红染色钙化结节，1%十六烷基吡啶半定量分析。蛋白裂解液（上海博彩生物科技有限公司）收集矿化诱导1、2、3周rDFC总蛋白，蛋白质印迹法检测Nkd2和成骨相关因子碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor-2，RUNX2）及骨钙蛋白的表达。

将第3~5代rDFC以10⁵个/ml的密度接种至6孔板。接种24 h待细胞融合约为80%，Lipofectamine RNAi Max转染试剂转染rDFC，Nkd2 siRNA工作浓度为50 nmol/L，转染时使用减血清培养基（siRNA组，Si组）。siRNA靶序列为GCACTCCAGTGTGATG，正义链：5'-GCACUCCAGUGUGAUGUCUdTdT-3'，反义链：3'-dTdTCGUGAGGUCACACUACAGA-5'（广州锐博生物科技有限公司合成）。阴性对照组为阴性对照RNA组（negative control RNA，Nc组）（购自广州锐博生物科技有限公司），转染方法与目的基因siRNA转染方法相同，空白对照组（mock control group，Mock组）无小RNA，仅加等量的转染试剂和Opti-MEM培养基。转染6~8 h后换矿化诱导液，诱导5 d后收集总RNA，7 d后收集总蛋白。通过蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）法检测Nkd2和成骨相关因子ALP、RUNX2和骨钙蛋白的表达。qPCR的引物序列见表1。

本实验中采用均值±标准差表示定量实验数据，所有实验至少独立重复3次。实验结果采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，对正态分布和方差齐性的样本，采用单因素方差分析；方差不齐者，则采用非参数检验。检验水准为双侧α=0.05。

见图1。免疫组化结果显示，Nkd2在大鼠牙囊组织近根侧表达随时间推移而变化：出生第1天，大鼠牙胚处于帽状发育期，牙囊中Nkd2呈阳性表达，成釉器中无表达，牙槽骨阳性表达（图1B）；第3天牙胚处于钟状晚期，牙囊组织中Nkd2达峰值（图1C）；自第5天起Nkd2表达降低，并持续阳性至第9天（图1D，图1F）；第11、13天牙根开始形成，Nkd2在牙囊组织中弱阳性表达且近牙槽骨侧表达高于近牙根侧。

见图2,图3,图4。rDFC波形丝蛋白和角蛋白细胞免疫组化染色显示，波形丝蛋白染色阳性（图4C），角蛋白染色阴性（图4E），说明本实验中rDFC来源于牙源性间充质。

rDFC矿化诱导0、1、2、3周时茜素红染色结果见图5，随诱导时间增加矿化结节明显增多。诱导0、1、2、3周十六烷基吡啶吸光度值分别为0.017±0.005、0.702±0.044、1.812±0.531、2.767±0.253（F=67.77，P=0.000），矿化组各时点与0周组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。蛋白质印迹法结果见表2及图6，矿化诱导前期Nkd2较对照组表达量显著增加（P<0.05），随诱导时间增加Nkd2表达下调，ALP、RUNX2及骨钙蛋白的表达显著上调（P<0.05）。

Nkd2：裸露角质蛋白同源物2；ALP：碱性磷酸酶；RUNX2：Runt相关转录因子2；OCN：骨钙蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

siRNA-r-nkd2转染rDFC 48 h收集总RNA，72 h收集总蛋白，qPCR和蛋白质印迹法检测Nkd2沉默效率（表3，图7A）。转染成功后收集矿化诱导5 d总RNA和7 d总蛋白，qPCR和蛋白质印迹法结果显示：瞬时干扰rDFC中Nkd2的表达，Si组较Nc和Mock组ALP、RUNX2及骨钙蛋白表达均下调，矿化能力显著下降（表4，图7B），差异均有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色显示Si组较Nc和Mock组钙化结节形成减少（图8）。Si、Nc及Mock组十六烷基吡啶吸光度值分别为0.29±0.07、0.64±0.08、0.58±0.05（F=39.02，P=0.000），Si组与Nc和Mock组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。

A：肉眼观；B：镜下观；Si组：小干扰RNA干扰组；Nc组：阴性对照RNA组；Mock组：空白对照组；肉眼观显示3组十六烷基吡啶洗脱液颜色；镜下观示低倍镜下3组茜素红染色的钙化结节

体外研究已证实，Wnt信号通路参与牙囊细胞成骨向分化。经典Wnt信号通路激活剂氯化锂刺激牙囊细胞后胞内总β-联蛋白表达增加，并促使其向核内转移伴成骨因子上调^[6]。rDFC成骨向诱导早期Wnt3表达增强，结合Wnt3在大鼠牙发育中的时空表达，提示Wnt3可能参与rDFC的早期成骨向分化^[7]。Yang等^[8]推测赫特维希上皮根鞘中的Wnt3a在上皮-间充质相互作用中通过Wnt/β-联蛋白促进rDFC成骨/成牙骨质向分化，而非来自于牙囊组织的Wnt3a。Wang等^[9]发现人牙齿发育过程中Wnt3仅表达于牙源性上皮，而Wnt5a、转录因子（β-联蛋白等）在牙源性上皮和间充质中均有表达。

斑马鱼发育中随Wnt/β-联蛋白通路的激活Nkd1和Nkd2表达增加；过表达Nkd2在斑马鱼发育的早期阶段抑制Wnt/β-联蛋白通路导致独眼畸形、中内胚层中间融合缺陷等^[10]。目前Nkd2与干细胞成骨向分化的研究较少。Jilka等^[11,12]证实甲状旁腺激素通过Nkd2与Wnt/β-联蛋白通路，参与成骨前体细胞的分化，促进骨松质成骨和骨膜下成骨。蛋白组学研究发现，Nkd2参与影响颅面骨发育的转化生长因子α的外泌过程^[13,14]。牙髓细胞的成牙本质细胞向分化过程中，Nkd2在细胞增殖阶段表达下降，早期矿化阶段表达增高^[15]。Eyckmans等^[16]仅将Nkd2作为干细胞成骨分化经典Wnt/β-联蛋白通路激活和早期成骨的标志。本实验诱导rDFC成骨向分化早期Nkd2表达明显上调，沉默Nkd2后rDFC成骨能力明显下降。说明Nkd2在牙源性干细胞成骨/成牙本质向分化的早期阶段起正向调控作用。

Zhang等^[17]检测15.5 d小鼠胚胎发现Nkd1/2表达于头面部间充质；而William等^[18]则支持Nkd2在小鼠胚胎9.5 d开始表达且呈周期性波动。动物模型Nkd1/2单突变小鼠可见轻微体型变小，双突变者鼻骨短小，头部颅骨缝未闭合^[17]。上述研究均提示Nkd1/2正向调控颅面部骨骼的发育，但未涉及牙发育。本实验通过免疫组化法发现，出生后SD大鼠牙胚近基底侧牙囊组织中的Nkd2表达具有时空差异，出生第3天牙胚处于钟状晚期，根侧牙囊组织中Nkd2达峰值。Wise等^[19]扫描电镜观察到出生后第3天根侧牙槽骨出现活动性骨松质生成，牙胚根侧牙囊组织中骨形成蛋白2高表达。出生后第3天下颌第一磨牙牙胚冠方牙槽骨出现第1次破骨高峰，表层牙槽骨呈扇形吸收^[20]。Nkd2在出生后第11、13天牙颈部釉质牙骨质界周围的牙囊组织中Nkd2分布呈梯度性，近牙槽骨侧显著高于近牙槽骨侧。牙萌出第2次破骨高峰为出生后10 d左右，根侧牙槽窝内骨松质增厚骨壁，第一和第二磨牙间的牙槽嵴增高^[19]。Nkd2表达与牙槽窝内周期性骨生成一致，说明根侧牙囊组织中Nkd2可能促进牙槽窝内的骨生成。

作为Wnt/β-联蛋白信号通路的调控蛋白和负反馈抑制剂，Nkd2与Wnt/β-联蛋白信号通路中的β-联蛋白在牙发育的牙囊组织中表达不尽一致。Du等^[6]研究发现β-联蛋白在出生后1~3 d的大鼠牙囊组织中无表达，出生第5天牙胚周围的牙囊组织中开始表达β-联蛋白，第7天表达明显增强，第9天β-联蛋白达峰值并持续至第13天。Zeng等^[21]则支持胚胎时期Nkd的初始转录源于早期分节基因的活性。Lei等^[22]发现小鼠胚胎发育晚期同源盒基因Hoxc8参与调控成骨细胞的分化。所以并非所有Nkd2的转录均需Wnt/β-联蛋白通路，牙发育中Nkd2的具体表达机制仍需进一步研究。

综上所述，Nkd2在rDFC成骨向分化早期起正向调控作用；Nkd2在大鼠牙发育基底侧牙囊组织中的表达具有时空差异，可能参与牙槽骨的生成。本研究为进一步探究Nkd2在牙囊细胞成骨分化中的具体分子机制提供了实验依据。