21-羟化酶缺陷症（21-OHD）是先天性肾上腺皮质增生症（CAH）最常见的类型，临床常分为失盐型（salt-wasting，SW型）、单纯男性化型（simple-virilizing，SV型）和非经典型（noclassical，NC型）。酶活性缺陷的不同，导致表现为不同程度的失盐症状和高雄激素血症^[1,2,3,4,5]。由于CYP21A2基因突变导致21-羟化酶活性的受损程度直接影响疾病严重程度^[6,7,8,9,10]。SV型患者占经典型21-OHD患者总数的25%，酶活性多为部分缺乏（2%~11%），患者糖皮质激素和盐皮质激素合成部分受阻，女性主要表现为性发育异常^{[5,6,11,12,13,14]}。46 XX患儿出生时外生殖器性别难辨，儿童期生长速度较同龄人快，骨骺提前闭合，最终身高往往低于正常人的平均身高，多数患者常因外生殖器畸形而就诊。临床医生在初次接诊患者时往往对此病认知度不足，导致误诊和漏诊，错过早期治疗时机。外生殖器异常对患者的婚育产生严重影响，给患者及其家庭造成严重的心理创伤^[15]。

21-OHD的致病基因为CYP21A2，人类同时存在具有编码功能的CYP21A2及无功能的CYP21P假基因，定位于6号染色体短臂（6p21.3），两者同源性高达98%；正是由于高度同源性的假基因存在，导致针对CYP21A2基因的Sanger测序一直存在难度，且假基因的干扰，也使二代靶向测序有较大障碍^[16]。既往文献研究此类疾病病例样本较小，本研究回顾分析2015年1月至2018年3月期间就诊于上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科，临床诊断为SV型21-OHD患者的临床资料，同时采用巢式PCR方法对患者的CYP21A2基因进行测序，旨在提高对本病的认识。

选取2015年1月至2018年3月期间就诊于上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科临床诊断为SV型21-OHD患者，共33例，就诊年龄18~38岁。所有患者均依据临床表现及激素水平结果进行临床拟诊，经CYP21A2基因检测确诊为21-OHD，实验室检查及影像学资料齐全。本研究获得患者知情同意，同时获得上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准（批文号：沪九院伦审[2015]139）。

（1）临床表现，就诊年龄、是否身材矮小、男性化症状（乳房发育情况、有无原发性闭经、有无喉结发育、阴毛分布类型、生殖器发育情况等）、抚养史、手术史和药物治疗史。（2）抽取患者静脉血检测生化指标及17-羟孕酮（17-OHP）、雄烯二酮（AD）、睾酮、脱氢表雄酮（DHEA-S）、血皮质醇（8∶00）、醛固酮（8∶00）、孕酮、促肾上腺皮质激素（ACTH）等相关激素水平；其中，ACTH、AD、睾酮、DHEA-S、孕酮采用化学发光法测定（Abbott Laboratories公司）。17-OHP采用放射免疫法测定（北京原子高科股份有限公司）；肝肾功能、血电解质等以全自动生化仪测定。（3）行上腹部或肾上腺CT检查。与肾上腺肿瘤或其他肾上腺疾病鉴别。

所有患者均采用G带法查染色体核型。

在获得知情同意后抽取患者静脉血4 ml，用血液基因组DNA提取试剂盒（DP318，北京天根生化科技公司）提取全基因组DNA。基于GenBank数据库中CYP21A2（Gene ID 1589）和CYP21A1P（Gene ID 1590）序列比对的结果进行设计。通过Autoassembler 2.0软件分析真假基因之间碱基的差异。选取真假基因差异最明显的位置设计引物（引物设计软件为ABI Primer Express 2.0）。具体操作见参考文献[16]。使用ABI 3730xl DNA测序仪对已纯化的PCR扩增产物进行检测。所有样本均双向测序。使用Chromas软件将PCR产物测序结果与UCSC提供的CYP21A2基因各外显子序列进行比对，最后确认突变类型。

采用SPSS 14.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，计数资料以例数（%）表示。

共纳入33例21-OHD患者，就诊年龄18~38（26.3±6.5）岁。33例患者经染色体核型检测，29例为46 XX，4例为46 XY（分别为例4、例7、例30、例32）。本组患者均表现为身材矮小，身高（148.3±6.5）cm；例17在幼年时曾用醋酸可的松治疗，至成年期身高达到158 cm，为本组46 XX患者中唯一成年身高达到正常范围者。29例46 XX患者中，89.65%（26/29）表现为阴蒂肥大或小阴茎、原发性闭经，82.76%（24/29）表现为乳房未发育，55.17%（16/29）表现为声音增粗等男性化症状；4例46 XY患者主要表现为男性假性性早熟。5例患者有家族史，例2和例3为同胞姐妹，例30、例31和例32来自同一家系。33例患者中，6例（例4、例7、例24、例26、例30、例32）自幼按男性抚养，其中2例（例24、例26）染色体核型为46 XX，出生时阴蒂肥大似小阴茎，伴尿道下裂，大阴唇似对裂阴囊，均在2014年行全子宫+双附件切除术。其余27例出生时均按女性抚养，21例患者接受了手术治疗，其中19例行阴蒂成形术，2例行乳房整形术。

由表1可见，33例青春期后患者初诊时的血清17-OHP明显升高，90.9%患者>38.00 μg/L，AD明显升高，93.9%患者>10.00 μg/L，睾酮、DHEA-S、孕酮、ACTH均不同程度升高，8：00时的血皮质醇、血醛固酮正常或稍偏低。黄体生成素、卵泡刺激素、催乳素、雌二醇基本在正常范围。血常规、血电解质、肝肾功能等均未见明显异常。

26例患者行肾上腺增强CT或上腹部增强CT检查，显示不同程度的单侧或双侧肾上腺增大、增粗（图1）。

33例患者的CYP21A2基因测序结果见表2，基因突变频率见表3，部分基因突变类型见图2。基因测序结果显示有13种突变，I173N（c.518 T>A）、I2G（c.293-13A/C>G）、Q319*（c.955 C>T）、V282L（c.844G>T）、S494N（c.1481 G>A）、L308Ffs*6（c.923dup）、R357W（c.1069C>T）、P31L（c.92C>T）、L307Ffs?（c.923_924insT）、R484W（c.1450C>T）、Q290*（c.868 C>T）、R328W（c.982 C>T）、Y48H（c.143T>C），其中I173N和I2G分别占40.00%和18.33%。值得注意的是，4例患者出现CYP21A2基因多个位点突变的情况，如例10存在c.518 T>A，c.923_924insT，c.955 C>T，c.844G>T以及c.1069C>T的突变，且突变位点均为假基因的序列，考虑该例患者存在大片段缺失后，导致真基因和假基因融合的情况；而例11存在L307Ffs?（c.923_924insT）、R484W（c.1450 C>T）和Q319*（c.955 C>T）突变，考虑可能与真假基因间的小片段互换有关。

21-OHD是CAH最常见的类型，系由CYP21A2基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病^[1,3,7,10]。SV型21-OHD患者的临床表现在46 XY患者为假性性早熟，46 XX患者则以性发育异常和男性化为主，由于雄激素水平的升高，骨骺提前闭合，最终身高低于同龄人的平均身高等^[2,3,11,12]。本组病例所有患者均存在身材矮小[身高（148.3±6.5）cm]，46 XX的患者89.65%有阴蒂肥大或小阴茎、55.71%的患者有喉结发育和声音增粗，青春期后的患者，原发性闭经和乳房未发育等男性化症状也有较高发生率。

本组病例多数患者就诊年龄较晚（26.3±6.5）岁，患者身高显著低于正常人，分析原因为持续的高雄激素血症导致患者早期生长加速，骨龄提前，骨骺闭合提前，幼年时比同龄儿童高大，但最终身高却不及正常成人。在46 XX患者中，例17在幼年时得到诊断，儿童期曾用醋酸可的松治疗，10岁后中断治疗；至成年期就诊时，身高达到158 cm，为本组46 XX患者中唯一成年身高达到正常范围者。Balsamo等^[9]研究发现，21-羟化酶残余酶活性2%~3%男性患者最终身高损失显著，成年身高明显低于其他组男性，同时还低于同组女性。因此，CAH患者开始糖皮质激素治疗的年龄，对其终身高具有重要影响。

本组33例患者青春期后初诊时的血清17-OHP和AD明显升高，睾酮、DHEA-S、孕酮、ACTH均不同程度升高，8：00时血皮质醇、血醛固酮正常或稍偏低。刘长勤等^[17]分析19例SV型21-OHD患者的临床和生化特点以及影像学资料，发现3例男性患者表现为第二性征发育提前，16例女性患者中87.5%原发性闭经，阴蒂肥大和/或阴唇融合；17-OHP、ACTH、DHEA-S和睾酮水平均明显升高；肾上腺增强CT扫描发现双侧肾上腺增生或腺瘤。SV型21-OHD 46 XX患者，原发性闭经是最常见主诉，17-OHP对于该型的诊断及疗效的监测有重要意义。

21-OHD的基因异常分为基因缺失、基因转换及点突变等，大部分的致病突变是基因转换，由CYP21A2和CYP21A1P间基因相互重组所致，另外有少数致病突变是自发突变。值得注意的是，并不是在所有21-OHD患者均存在明确的基因型和表现型的关系。230例中国人患者中，有89.6%患者表现为基因型和表型的相关性良好，但也有一小部分患者出现了表型的差异^[4]。Menassa等^[18]曾报道H62L与多种突变复合存在时会导致SV型21-OHD。王丽红等^[19]通过对14例21-OHD患儿血样应用高通量测序法（NGS）联合多重连接探针扩增技术（MLPA）对CYP21A2基因进行点突变和大片段缺失/重复检测，利用Sanger测序验证获选的变异位点，结果发现SV型最常见的突变为I173N （5/10）。国内有研究显示SW型、SV型和NC型中最常见的突变分别是基因片段缺失、I173N和P31L点突变^{[17,20,21,22,23,24]}。本研究中发现I173N、I2G两种突变可能与SV型21-OHD的发生有关，与文献报道一致。

本研究采用巢式PCR技术，发现多数患者存在CYP21A2的复合杂合突变，例10，例11，例17，例18出现了多个基因突变的情况。经过进一步分析，发现例10存在c.518 T>A，c.923-924insT，c.955 C>T，c.844G>T以及c.1069C>T的突变，且突变位点均为假基因的序列，考虑该例患者存在大片段缺失后，导致真基因和假基因融合的情况。例11存在c.923-924insT，c.955 C>T和c.1450C>T的多种突变情况，此片段存在小片段的基因交换。由于真假基因的高度同源性，导致该区域在真假基因之间出现DNA重组，而采用巢式PCR的方法，分段扩增再进行Sanger测序，易于检测突变，但不利于发现大片段基因缺失后发生融合的部位。Lee^[25]用Southern和扩增建立限制性酶切位点方法对这种片段缺失和重排进行了深入研究，发现在31个中国台湾CAH家系中，有6个家系存在3.2 kb TaqI的片段，为CYP21P/CYP21A2的真假基因融合。近年的研究多采用MLPA进行基因片段重排的研究，并进一步验证新发突变对21-羟化酶活性的影响程度，能提高基因诊断阳性率及临床参考价值。

21-OHD患者的治疗需要根据不同类型选择个性化治疗方案。药物治疗主要是通过激素替代治疗预防临床危象，同时合理抑制高雄激素血症。目前替代治疗的类固醇制剂包括氢化可的松和9-α氟氢可的松。对于SV型，主要是采用糖皮质激素抑制替代治疗，抑制雄激素但不导致皮质醇增多的临床和代谢异常，及时监测和调整剂量。张险峰等^[13]报道了32例21-OHD（其中28例SV型患者）通过糖皮质激素治疗，可以改善高雄激素血症，但增加了患者胰岛素抵抗以及代谢综合征发生风险，提示我们在糖皮质激素替代治疗过程中需严格监测，及时调整剂量，预防代谢紊乱发生。对于有明显的生殖器男性化（Prader分级≥3级）的女婴需要早期（<6月龄）进行阴蒂成形手术，手术过程中应注意保留勃起功能和阴蒂的神经支配。因此，21-OHD临床诊断后，建议立即进行糖皮质激素抑制替代治疗，抑制高雄激素血症，对青春期后的患者应建立正常的月经周期，改善患者的生育能力。遗憾的是，本研究中患者就诊年龄普遍较晚，骨骺已闭合，身高难以改善。因此，对于21-OHD患者早期诊断和早期治疗具有重要的临床意义。在该病的治疗中，不同阶段的治疗目标、糖皮质激素制剂的选择和给药方式等还存在争议，建立针对21-OHD患者长期治疗随访的前瞻性随机对照研究具有重要的临床意义。