不同剂量阿利吉仑对快速心房起搏犬肾素血管紧张素系统的影响

心房颤动是临床上常见的复杂性心律失常之一，其患病率在过去的几十年中随着人口老龄化而增加，其高发的血栓栓塞并发症增加了患者的致残、致死率^[1]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)与心房颤动的发生、发展密切相关。荟萃分析结果表明，抑制RAS系统，对控制心房颤动的复发具有安全、有效及耐受性好的优势^[2]。直接肾素抑制剂阿利吉仑在第一环节阻断RAS，降低血浆肾素活性，明显降低血浆及组织中血管紧张素(Ang) Ⅰ、AngⅡ水平^[3]。我们于2014年1—12月通过建立快速心房起搏犬心房颤动模型，探讨RAS在心房颤动发生中的变化和机制，观察阿利吉仑对快速心房起搏心房颤动犬模型心房肌组织中RAS表达的影响。

材料和方法

一、实验犬和分组

健康成年杂种犬24只(由天津市利群实验动物服务中心提供)，体重12～18 kg，性别不限。数字抽签随机分为4组：假手术组、心房起搏对照组、心房起搏＋阿利吉仑(由诺华制药有限公司馈赠)10 mg·kg^－1·d^－1组(阿利吉仑，低剂量组)，心房起搏＋阿利吉仑20 mg·kg^－1·d^－1组(高剂量组)，每组6只。

二、方法

1．试剂与设备：

总RNA提取试剂盒购自New Industry公司，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，TRIzol购自日本TaKaRa公司，100 bp Plus DNA Ladder购自加拿大Fermentas, Oligo d (T)18 Primers购自日本TaKaRa公司，台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorff公司；紫外-可见光分光光度计(UV-240)购自日本Shimadzu岛津公司；MilliQ超纯水系统购自法国Millipore公司；RT-PCR仪(GeneAmp2400)购自美国Perkin Elmer公司，电泳仪购自美国Bio-rad公司，凝胶成像系统购自美国Gene公司。

2．犬模型建立：

3%戊巴比妥钠30 mg/kg经胫前静脉充分麻醉后，仰卧于手术床上，气管插管连接呼吸机行机械通气，备皮右胸前区及颈背侧部，继之称质量。术前连接TOP-2001型多道电生理记录仪(TOP-2001，宏桐实业有限公司，上海)同步记录体表心电图。常规消毒铺巾，充分暴露颈外静脉，经颈部右侧切口，切开皮肤及分离皮下组织，分离出颈外静脉后穿刺置入起搏电极经上腔静脉至右心房，多道电生理记录仪记录到1∶1心房夺获提示电极到达右心房并起搏良好，由心脏超声(Sequoia C256, Siemens Medical Solutions,美国)确认电极位置在右心房或右心耳，电极远端连接电生理刺激仪(DF5A，东方电子仪器厂，苏州)给予起搏刺激，缝线固定电极，以免脱落。电极远端连接心房起搏器(复旦大学旦华科技公司，上海)，测量起搏电压、电流、脉宽、电阻等参数符合标准后，将起搏器埋置于肩胛间区皮下作长约3～4厘米切口做囊袋，逐层缝合皮肤，局部纱布包扎。术中遵循无菌操作，术中应用抗生素预防感染。起搏器起搏模式为AOO，起搏电压5 V，脉宽0.2 ms，频率500次/min，脉冲输出可关闭/开启(磁铁控制)，维持起搏2周。假手术组植入起搏器的方法同上，但不行起搏刺激和药物干预。低剂量组、高剂量组分别于起搏开始前3 d开始给予口服阿利吉仑10 mg·kg^－1·d^－1和阿利吉仑20 mg·kg^－1·d^－1 ，维持至实验结束。

3．标本采集：

各组犬在实验进行2周后，经戊巴比妥钠30 mg/kg充分静脉麻醉，仰卧位固定于手术台上，气管插管接人工呼吸机辅助通气后，沿胸骨正中线切开皮下组织及胸骨前肌肉，开胸暴露心脏，迅速取下心脏，置于0℃冰水中，随后采集数份右心房肌不同位置的标本(约1 g/份)置于提前备好的组织冻存管中，并标记组别，放置于液氮冷冻后并立即转入－80℃冰箱保存，备行RT-PCR实验。

4．心房肌组织中血管紧张素转换酶(ACE)和AngⅡ水平的测定：

取心房肌组织块(0.5 g)，在0.9%冷生理盐水中进行漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取100 mg，放入10 ml的小烧杯内。用移液管量取冷生理盐水，使其体积总量是组织块质量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入研钵中，再将剩余的1/3生理盐水冲洗残留在烧杯中的组织碎块，一起倒入研钵中进行手工碾碎，右手持杵研磨数6～8 min，充分研碎，使组织匀浆化。随后将制备好的10%匀浆用低温低速离心机1 000 r/min离心15 min，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。取适量上清液进行测定。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定心房肌组织中ACE及AngⅡ水平，具体方法严格参照各说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

5．反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：

应用Trizol法提取组织RNA，除去RNA中基因组DNA，电泳确认是否除去基因组DNA。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。紫外分光光度计检测RNA的含量。取逆转录产物进行PCR循环。在GeneBank中查找犬心房组织血管紧张素转换酶2(ACE2)、AngⅡ1型受体(AT1R)及β-actin的mRNA序列，根据引物设计要求，应用Primer 5.0或Gene Runner软件设计引物，由英骏生物技术有限公司合成。β-actin作为对照，应用PCR法扩增出相应的目的片段。PCR反应条件为，94℃预变性5 min，进入PCR循环：94℃变性40 s ，β-actin 51℃，ACE2，AT1R 55℃退火40 s ，72℃延伸40 s，37个循环后72℃再延伸7 min。

6．电泳：

取RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为5 μg，溴化乙啶染色。电泳结束后，经凝胶图像扫描仪采集图像和分析，对PCR电泳条带进行计算机灰度或密度扫描，以目的基因电泳带面积灰度值与β-actin内参电泳带面积灰度值之比作为该例标本目的基因表达量的相对值。各组实验重复6次。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P< 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组心房肌组织中ACE及AngⅡ水平检测结果

假手术组心房肌组织中ACE、AngⅡ分别为(1.18±0.24)ng/mg、(10.61±2.24)ng/mg；快速心房起搏2周后，分别为(2.38±0.50)ng/mg、(26.16±4.09)ng/mg；应用阿利吉仑进行干预后，低剂量组(1.54±0.27)ng/mg、(19.41±2.05)ng/mg，高剂量组(1.45±0.31)ng/mg、(14.26±1.99)ng/mg，心房肌组织中的ACE及AngⅡ水平降低，且AngⅡ水平与阿利吉仑呈剂量依赖性(F值分别为17.32、39.78，均P<0.01)。

二、各组犬心房肌ACE2、AT1R PCR产物电泳图

见图1、图2。快速心房起搏2周后，AT1R基因表达水平明显升高，ACE2基因表达水平降低，应用阿利吉仑干预后AT1R表达减少，呈剂量依赖性，ACE2基因表达增加，无剂量依赖关系，见图3、图4。

图1

阿利吉仑对ACE2 mRNA表达影响的电泳图

注：ACE2：血管紧张素转换酶2，1、2、3、4分别为假手术组、心房起搏对照组、低剂量组、高剂量组；图3同

图1

阿利吉仑对ACE2 mRNA表达影响的电泳图

图2

阿利吉仑对AT1R mRNA表达影响的电泳图

注：AT1R：血管紧张素1型受体，图4同

图2

阿利吉仑对AT1R mRNA表达影响的电泳图

图3

阿利吉仑对4组犬心房肌组织ACE2 mRNA表达的影响

注：与假手术组比较，^aP<0.05，^bP<0.01；与心房起搏对照组比较，^cP<0.01；与低剂量组比较， ^dP<0.01；图4同

图3

阿利吉仑对4组犬心房肌组织ACE2 mRNA表达的影响

图4

阿利吉仑对4组犬心房肌组织AT1R mRNA表达的影响

图4

阿利吉仑对4组犬心房肌组织AT1R mRNA表达的影响

讨论

RAS与心房颤动的发生和发展紧密相关，我们先前的研究也提示干预RAS系统可能成为预防和治疗心房颤动的新方法^[4]。在研究中，我们通过对实验犬进行快速心房起搏来诱发心房颤动，构建心房颤动犬模型，成功率高，实验方法可靠。Nakashima和Kumagai^[5]发现，心房的重构可作为心房颤动发展必要的解剖基础；犬经心房起搏2周后，心房有效不应期缩短、心房内传导时间和诱发后心房颤动持续时间较基础值明显延长，这些变化与心房颤动的发生、发展过程类似。

RAS的主要活性肽是AngⅡ，其生物学作用是通过AT1R和AngⅡ2型受体(AT2R)介导。同时研究发现心房颤动患者心房组织ACE水平是窦性心律者的3倍^[6]。AngⅡ主要生物效应为缩血管、增加心肌收缩力、刺激醛固酮分泌等，是促进心房扩大，心房肌细胞肥大和心房纤维化及心房肌动作电位时间缩短的重要因素。RAS在心房颤动的发生和维持中发挥着重要作用，并影响心房的重构^[7]。依那普利、厄贝沙坦和血管紧张素-(1-7) [Ang-(1-7)]可抑制起搏后的RAS系统激活，降低心房颤动的易感性，应用依那普利、厄贝沙坦和Ang-(1-7)可使ACE2 mRNA表达水平增加和AT1R mRNA表达水平水平下调^[8]。依那普利、厄贝沙坦及Ang-(1-7)可通过降低ERK1/ERK2基因表达以减轻心房纤维化。厄贝沙坦和Ang-(1-7)可预防起搏造成的动作电位时程缩短和频率适应性下降^[9]。

ACE可能通过左心房结构重构在心房颤动发生与维持中发挥重要作用。ACEI/ARB均不能完全阻断RAS，ACEI直接抑制ACE催化AngⅠ转化为AngⅡ，因此在用药早期AngⅡ下降，但是AngI代偿性的升高。ARB阻断AngⅡ与其受体结合，因此用药后出现AngI和AngⅡ代偿性升高。相比之下，直接肾素抑制剂(DRI)由于直接抑制肾素催化血管紧张素原转化为AngI，因此AngI和AngⅡ在用药后都是下降的，在动物实验或者临床试验中都验证了以上结果^[10,11,12]。因此， DRI可能比其他RAS阻断剂能更加有效地抑制局部RAS的活性。与ACEI和ARB相比阿利吉仑与血浆蛋白的结合率高并且有更好的组织渗透性^[13]。对比ACEI和DRI，DRI用药后的人体肾血流量的反应性大于ACEI ^[14]。RAS成分不仅存在于细胞膜上，细胞内也同时存在^[15]。阿利吉仑不但显著地抑制了心脏局部组织内的AngⅡ，而且能显著地抑制了心肌细胞内的AngⅡ^[16]。这些研究结果提示，阿利吉仑可能比传统的ACEI和ARB更能抑制RAS活性，尤其是在组织水平和细胞水平。实验中，我们发现起搏后犬心房肌组织中ACE和AngⅡ浓度明显升高，而应用阿利吉仑进行干预后，心房肌组织中的ACE和AngⅡ水平明显降低，且AngⅡ降低的水平与阿利吉仑的用量呈剂量依赖性。

ACE2为RAS系统中重要的负向调节酶，参与RAS中的一个旁路^[17]。这种羧肽酶的特性之一是对AngⅡ水解的高催化率^[18,19]。它具有降低心脏局部AngⅡ的浓度，拮抗AngⅡ的生理活性的功能，且其代谢产物Ang-(1-7)也具有抑制细胞增殖、抗血栓形成、稳定心肌电活动等心脏保护作用。在实验中发现起搏组ACE2较对照组明显降低，提示ACE2表达水平的下调亦为RAS激活的一部分，其对AngⅡ的水解减少，使ACE-AngⅡ-AT1R轴进一步活化，促进了心房纤维化的发展，从而利于心房颤动的发生和维持。在心房颤动犬模型中，Zhou等^[20]ACE2的过表达能够显著抑制心房胶原蛋白的积聚，并且显著改善左心房的重构。应用阿利吉仑干预后ACE2基因表达增加，而AT1R表达减少，表明阿利吉仑可以有效拮抗RAS的活性，减轻心房纤维化，对心房颤动的预防和治疗可能具有有益的作用。阿利吉仑对心脏的保护作用可能是通过抑制心肌组织中ACE和AngⅡ水平、下调AT1R和上调ACE2基因表达水平来介导的。我们在实验中，在防治心房颤动方面阿利吉仑具有一定的量效关系。

综上所述，阿利吉仑在快速心房起搏犬模型中对心房结构重构的保护作用，为心房颤动的上游治疗提供新的思路和途径。