肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)主要表现为远端肺小血管的异常收缩和重塑^[1]。肺小血管是肺循环阻力的重要组成部分^[2,3]，其结构与功能的改变是肺动脉高压研究中不可或缺的部分。20世纪80年代，在Bevan和Osher^[4]提出的测定血管张力技术的基础上，Mulvany和Halpern等^[5]将该技术改进并开发出较为完善的肌动描记血管环张力测定技术。血管环张力测定技术在心脑血管研究广泛应用，逐渐推广应用于肺血管疾病^[6]、肾脏疾病^[7]和肿瘤^[8]发病机制等研究领域。血管环实验技术可检测内径在0.03～3.00 mm范围的多种血管张力变化，主要用于研究血管活性机制、血管生理病理改变、药物作用和药理学机制等。目前肺血管疾病的发病机制复杂且不明确，临床缺乏有效的诊治手段^[9]，该检测技术的发展和普及有利于更深入直观地研究肺血管疾病的发病机制和药物治疗作用。本研究旨在制备初始张力合适、舒缩活性良好的肺动、静脉血管环，最大程度模拟血管在生理或病理机体内的状态，建立肺动、静脉标准化离体血管环张力实验方法，为进行肺血管功能或药理学研究提供技术基础。

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雄性Sprague－Dawley大鼠，体重200～250 g，购于广东省实验动物中心[许可证号：SCXX(粤)2008－0002]。由呼吸疾病国家重点实验室实验动物中心饲养，自由饮食。本研究经过广州医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准实施[批号：伦(审)2017－09]。

Krebs－Henseleit液(NaCl 127 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L, CaCl₂ 2.5 mmol/L, NaHCO₃ 17 mmol/L, K₂HPO₄ 1.18 mmol/L, MgSO₄·7H₂O 1.17 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L；pH值为7.4)、高钾Krebs－Henseleit溶液(NaCl 127 mmol/L，KCl 60 mmol/L，CaCl₂ 2.5 mmol/L，NaHCO₃ 17 mmol/L，K₂HPO₄ 1.18 mmol/L，MgSO₄·7H₂O 1.17 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L；pH值为7.4)；去氧肾上腺素(PE)购于上海禾丰制药有限公司；乙酰胆碱购于美国Sigma公司；血栓烷素类似物(U44619)购于美国Sigma公司；罂粟碱购于湖南一格制药有限公司；Multi Myograph System－620张力测定仪(丹麦A/S公司)；Biopac数据采集分析系统(美国Biopac公司); 40 μm金属丝(澳大利亚AD Instruments公司)；传感器校正工具箱；体式显微镜(重庆奥特公司)；0.1 mm直头显微镊、0.15 mm维纳斯显微剪(上海金钟公司)；明胶分离皿；METTLER－TOLEDO pH计(瑞士梅特勒－托利多公司)。

大鼠用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后，腹部朝上固定在小动物手术台上。乙醇消毒胸腹部皮肤，在剑突下位置依次剪开皮肤和肌肉，充分暴露横膈肌。将针头与压力换能感受器连接，在横膈肌三角形区域的右心膈角处插入右心室，同时记录小动物生理记录仪的右心室压力变化波形，计算右心室平均压。

按文献[10]的方法，迅速取出大鼠心肺组织置于预冷氧饱和的Krebs－Henseleit溶液中，将离体心肺呈仰卧位固定在分离皿上，持续加入预冷氧饱和的Krebs－Henseleit溶液保持组织湿润。在体视显微镜下剪去胸腺和周围脂肪组织，根据生理解剖位置找到肺动、静脉近心端，使用显微外科镊和显微剪按照气管伴行方向逐步分离肺动、静脉，过程中尽量减少牵拉血管。清除残留在血管内的血液，制备内径为200～400 μm，长度为2 mm左右的肺小动静脉血管环。分离肺动、静脉过程中需保持动作轻柔，避免用力牵拉和剪破血管壁以保持血管的完整性和生理活性。

截取合适长度的不锈钢金属丝，在体视显微镜下将金属丝穿过血管环的管腔，用分离镊夹取金属丝的两端将血管环迅速转移到加入5 ml Krebs－Henseleit溶液并预先加热至37 ℃的浴槽中。用螺丝刀将金属丝两端固定在连接螺旋钮的固定架上，旋转螺旋钮使两个固定架互相靠近。同样方法将第二根金属丝缓慢穿过血管管腔，固定在连接传感器的固定架上。穿金属丝的过程中要注意动作缓慢轻柔避免损伤内皮组织。

首先测量血管长度L(mm)，读取螺旋测微器的初始刻度(两个凹槽上的金属丝相互贴靠)X₀，按归零键使基线归零，然后旋转螺旋钮牵拉血管使其处于刚好不受力的状态，此时仪器显示为"±0.0 mN" 。平衡血管60 min，期间每隔20 min用预热的Krebs－Henseleit溶液更换浴槽内溶液，血管环的张力变化通过换能系统采集记录在电脑上。血管平衡后间隔3 min逆时针旋转螺旋测微器50 μm逐步牵拉血管环，记录此时螺旋测微器的刻度与初始刻度的差值，即2根金属丝之间的距离Xi(μm)和软件记录的血管环总张力Fi(原始单位为mN，换算为mg)，计算单位血管环张力Ti(Ti＝Fi/2L, mN/mm)、血管内周长ICi[ICi＝205.6＋2(Xi)，μm]和血管有效压强Pi(Pi ＝ 2πTi/ICi, kPa)，以横坐标为ICi、纵坐标为Ti绘制单位血管环的张力指数曲线，在此基础上做Ti＝Pi×ICi/2π的直线，此时压强Pi为肺动、静脉的有效压强，斜率与有效压强呈正比，曲线与直线交点的横坐标即为血管处于设定压强时的血管内周长IC₁₀₀，以此计算血管处于该压强时对张力变化感受最敏感的血管内周长IC₁(IC₁＝0.9×IC₁₀₀)，并将螺旋测微器调到对应的读数MicrometerX₁完成血管的初始张力标准化。

血管环完成初始张力标准化并平衡30 min后，用60 mmol/L高钾溶液预收缩3次使血管环达最佳收缩状态。在浴槽中加入终浓度为1 μmol/L的PE溶液，肺动脉环收缩达平台并稳定后加入终浓度为10 μmol/L乙酰胆碱舒张血管，其舒张反应>80%时认为内皮完整，研究非内皮相关性实验时去除内皮后舒张反应<20%则认为内皮基本去除^[11]。在浴槽中加入终浓度为1 μmol/L U46619，肺静脉环收缩达平台并稳定后加入终浓度为10 μmol/L罂粟碱舒张血管，检测肺静脉环的舒缩活性。舒张度为加入乙酰胆碱或罂粟碱后张力变化数值与加入PE或U46619后张力变化数值的比值。

大鼠右心室压力呈正弦波型，舒张压为(1.2±0.8) mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，收缩压为(25.9±1.4) mmHg，右心室平均压为(12.4±0.5)mmHg(图1)，右心室压间接反映肺动脉压力的变化。

以同样的长度100 μm逐步递增血管环内周长去拉伸肺动、静脉环，其张力变化包括2个阶段：(1)张力的快速升高；(2)张力逐渐下降一定幅度稳定到平台。随着牵拉长度的不断增加，张力快速升高的幅度也随之增加，肺动、静脉环张力快速升高的最大幅度分别为0.10 mg和0.099 mg。肺静脉环张力稳定到平台前下降的最大幅度为0.085 mg，而肺动脉环下降的最大幅度为0.054 mg。肺静脉环总张力升高0.13 mg，其升高幅度弱于肺动脉环总张力(0.26 mg)。可见肺静脉环张力升高幅度不如肺动脉环稳定，可能与肺静脉血管环平滑肌层薄有关(图2)。

张力指数曲线与压强直线交点的横坐标分别为肺动脉压力为1.596 kPa(12 mmHg)和肺静脉压力为0.8 kPa(6 mmHg)^[12]时所对应的血管内周长，并计算出此时螺旋测微器的读数(图3，图4)。

1 μmol/L PE刺激肺动脉环收缩达0.39 mg，加入10 μmol/L乙酰胆碱舒张肺动脉环其舒张度达92%，肺动脉环内皮基本保持完整。1 μmol/L U46619刺激肺静脉环收缩达0.13 mg，加入10 μmol/L罂粟碱舒张肺静脉环其舒张度达84%(图5，图6)。

注：PE：去氧肾上腺素；U46619：血栓烷素类似物

血管环张力测定系统广泛应用于研究心脑血管疾病、肺血管疾病、肾脏疾病和肿瘤等。生理条件下血管内充满流动的血液处于充盈搏动状态，在张力测定的离体实验中，离体血管环浸泡在通混合气(95%O₂＋5%CO₂)的Krebs－Henseleit平衡溶液中，并通过两根金属丝牵拉血管给予一定的前负荷模拟近似生理或病理血管的在体状态，进行血管相关功能及药理学的研究。实验成功的关键是制备舒缩功能状态良好的血管环，需控制好血管环的自身条件和外在条件。外在条件的控制包括根据实验需要选择合适的平衡溶液、温度和酸碱度等。血管环自身状态的好坏与分离和固定操作密切相关。其实验原则是在体外尽可能的模拟在体的生理或病理条件，从而研究疾病的发病机制及进行药物研发，是重要的血管研究实验手段。

肺循环是个高容量低压力的循环系统，肺血管具有不同于体循环血管的生理机制，且肺动、静脉在解剖位置上和气管、肺组织紧密相连增加分离的难度，而且肺静脉的血管壁较薄。以上原因决定了离体血管环实验对肺血管疾病研究具有重要意义但实验难度较大。目前大多数研究的肺血管张力实验中，选取长度和内径大小不一致或病理状态下的肺血管环都给予相同的基础张力。但是肺动脉高压病理条件下肺血管的压力和阻力是增高的，而且不同长度和管径大小的肺血管的初始张力是不同的。若仍给予固定的初始张力，则不能反映真实的血管在体情况，在此基础上观察的数据可能会产生偏差，生理和病理条件下肺血管环实验相关指标也不能进行比较研究。因此在实验观察之前对血管进行标准化测定确定合适的初始张力具有重要意义，排除血管环长度、内径和不同生理病理状态等因素的干扰，可使得不同血管环之间具有可比性。

血管环的初始张力不是任意设定的，金属丝牵拉的长度太小，平滑肌肌丝未处于最适长度则不能使血管环产生最大的收缩张力，牵拉过度则会造成血管平滑肌的损伤。肺动、静脉血管环标准化测定是通过逐步牵拉血管环并记录对应的张力数值，制作横坐标为血管环内周长、纵坐标为单位血管张力的张力指数曲线，根据对应的肺动、静脉压力作压力曲线计算其最佳初始张力和血管环内周长^[13]。但目前由于实验技术的限制肺静脉压力变化不能直接测量，Hillyard等^[12]采用离体肺灌注的方法测量大鼠微小肺静脉(内径20～50 μm)压力约为9.3 cmH₂O(1 cmH₂O＝0.098 kPa)，左心房压力约为8 cmH₂O。正常情况下肺静脉压力约等于左心房压力，本研究采用内径200～400 μm的肺静脉环压力设定为6 mmHg。此外，肺静脉对多种血管活性物质的反应不明显，增加了研究的难度。乙酰胆碱引起的大鼠肺动脉舒张效应依赖内皮，因而可以通过乙酰胆碱的舒张度来反映内皮的完整性，而大鼠肺静脉环对PE引起的收缩反应和乙酰胆碱引起的舒张反应均不如肺动脉环明显，可能与其受体表达差异有关，这为实验前验证内皮完整性及开展肺静脉内皮相关的张力实验带来了一定的困难。Zhao等^[14]在血管张力实验后采用硝酸银对血管环内皮进行染色验证内皮完整性，但目前仍无公认的在离体血管环实验上验证肺静脉环内皮完整性的方法，有待进一步的研究探讨。血管环张力实验中刺激静脉环收缩的血管活性物质包括U46619、血管紧张素Ⅱ、5－羟色胺及内皮素－1等，U46619是血栓烷素TXA2受体激动剂具有较强的收缩血管的作用，罂粟碱可通过抑制环核苷酸磷酸二酯酶非特异性舒张肺静脉平滑肌^[15]，本研究采用U46619和罂粟碱反映肺静脉环的舒缩活性。

利用离体血管环张力系统标准化测定肺动、静脉张力需要测定血管的压力值，测定的结果受压力值选取的影响，这要求所测得的右心室压力要准确，而不同的仪器和方法测得的右心室压力会有所偏差。罂粟碱舒张肺静脉不依赖内皮，因而其引起的舒张效应不能反映肺静脉内皮的完整性。另外血管环实验只能研究血管对不同刺激的舒缩变化，由于无法完全模拟体内的复杂内环境及信号通路传导，所以本研究的实验结果并不能完全代表体内的反应，具有一定的局限性。血管环实验因实验时长的关系，对一些长效反应及迟发反应有可能无法观察到，造成假阳性或假阴性结果。并且肺循环血管肌层较薄，血管在分离固定过程中容易受到牵拉损伤，因此对实验者的技术要求较高。综上所述，本研究成功制备经血管环张力技术标准化测定后初始张力合适、舒缩活性良好的肺动、静脉血管环，建立肺动、静脉标准化离体血管环张力实验方法，为进行肺血管功能或药理学研究提供技术基础。