孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是以社会交往与沟通能力下降、语言发育迟缓、兴趣狭窄、行为和动作刻板为核心症状的神经发育障碍性疾病，是导致儿童残障最主要的疾病之一^［1］。美国1项ASD网络检测计划显示近年来ASD的患病率呈明显上升趋势^［2］。目前，ASD的病理生理机制尚不明确，越来越多的研究表明免疫相关因素起到了至关重要的作用^［3］。而间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种可高度自我增殖和具有多向分化潜能的多能干细胞^［4］，其自身还具有免疫调节的作用，可作为一种潜在的ASD的生物治疗手段。MSCs的治疗效果主要是通过其分泌的外泌体发挥重要的作用，相较于MSCs，无细胞治疗的外泌体具有更大的优势。因此，本文就MSCs及其外泌体（mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exos）治疗ASD的可能机制及其相关研究进展进行综述。

ASD的患病率近十余年来有显著的上升，这可能与对ASD认识的提高和诊断标准的扩大有关。1项纳入了74项研究的荟萃分析显示，ASD的全球患病率约为6‰^［5］。美国疾病预防控制中心2018年的调查数据显示，全美11个不同地区8岁儿童中ASD的患病率平均为23‰^［2］。国内尚没有大规模的流行病学调查数据，1项纳入44项研究的荟萃分析显示，我国ASD的患病率约为3.9‰^［6］。目前，临床上对ASD的治疗主要是对症治疗，使用药物缓解ASD患者焦虑、抑郁、注意缺陷与多动障碍等共病问题，但针对ASD的核心症状尚无有效的药物。此外，康复训练可以一定程度上缓解患者的核心症状，但需要耗费较大的人力及物力，给家庭和社会带来了巨大的负担^［7］。因此，迫切需要针对ASD更有效的治疗方法。近年来，越来越多的研究显示免疫相关因素在ASD的发病机制中发挥着重要的作用，这为ASD的生物治疗提供了新的方向。

随着细胞生物技术的进步，细胞疗法和基于细胞的生物制药成为一些尚无法治愈的疾病的一种潜在的治疗方法，其中干细胞在再生医学领域受到了较多的关注。MSCs是一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层，具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，其在体内或体外特定的诱导条件下，可以分化为心肌细胞、内皮细胞等多种组织细胞^［8］。MSCs在培养中相对容易扩增和分离，并且能够自我更新和分化，这使其成为治疗各种临床病症的一种潜在选择。此外，MSCs还可以分泌具有免疫调节、抗凋亡、抗炎、促血管生成、促有丝分裂和抗菌等相关分子，包括免疫抑制分子、生长因子、外泌体、趋化因子、补体成分和各种代谢物等，这些分子有助于免疫调节和具有营养作用^［9］。

目前较多的研究者提出，异常的免疫系统调节参与了ASD病理生理反应，ASD患者外周和中枢免疫系统存在持续的功能失调^［10］，进而可导致相关的炎症反应。异常的免疫炎症反应与ASD患者的症状严重程度存在一定的相关。

1.ASD的免疫炎症反应：在外周免疫炎症反应方面，多数学者认为ASD患者存在免疫细胞异常，有研究显示，与对照者相比，ASD患者外周血中自然杀伤细胞活化增加，活化B细胞和活化T细胞增多，ASD患者体内CD₃⁺、CD₄⁺、CD₈⁺T淋巴细胞失衡，同时还有单核细胞衍生的巨噬细胞出现功能失调^［11］。异常的免疫细胞可以分泌细胞因子，细胞因子刺激、调节免疫系统活性，并诱导自身及其他细胞因子的合成。Siniscalco等^［12］研究发现ASD患者外周血单核细胞中caspase-1基因表达增加，促进了促炎细胞因子IL-1β和IL-18的活化，从而导致体内炎症反应持续存在，除促炎细胞因子表达增加外，与对照者相比ASD患者外周血中抗炎细胞因子IL-4、IL-10、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）分泌减少。ASD患者的外周血异常免疫炎症反应表现为免疫细胞功能的失调以及促炎细胞因子分泌增加和抗炎细胞因子分泌减少。在中枢免疫炎症反应方面，目前针对ASD患者体内小胶质细胞的研究已经成为ASD免疫标志研究的一个新方向。ASD患者大脑内往往伴随着神经元的损伤以及突触功能的失调和可塑性破坏，神经元损伤后作为中枢神经系统内巨噬细胞的小胶质细胞会增生，并分泌促炎因子，而促炎因子具有直接的神经毒性作用。小胶质细胞过度激活会损害周围的健康神经组织，并诱导受损的神经元释放警报素和损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），这些因子又会激活小胶质细胞，从而形成恶性循环，大脑中激活的小胶质细胞会导致ASD样的行为^［13］。有研究显示ASD患者脑脊液的促炎因子显著增加，尸检结果显示，与健康对照者相比，ASD患者脑组织中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-γ（Interferonγ，IFN-γ）、IL-8显著增加^［14］。并且在这些大脑区域和脑脊液中其他免疫反应相关的基因表达增多，提示ASD患者的脑中促炎途径被激活。

2.MSCs治疗ASD的可能机制：在外周免疫方面，已有大量的研究报道了MSCs对免疫功能调节的作用。有研究表明，MSCs可以调节外周免疫细胞的活性，如促进调节性T细胞的产生，减少B细胞的活化和增殖，抑制自然杀伤细胞的增殖和细胞毒性以及抑制树突状细胞的成熟，此外MSCs可以抑制体内外免疫细胞促炎因子的产生和促进抗炎因子的释放^［15］。MSCs可以通过抑制TNF-α和INF-γ等促炎因子的产生来抑制相关免疫细胞的增殖和扩增，增加IL-10水平促进调节性T细胞的产生^［16］。综上所述，ASD患者存在免疫细胞的失调以及促炎细胞因子分泌增加和抗炎细胞因子分泌减少，MSCs的免疫调节作用有可能恢复这种免疫失衡。

在中枢神经系统方面，MSCs对神经系统的作用机制尚不完全清楚，可能有以下2种机制：MSCs具有免疫调节作用，能够穿越血脑屏障并迁移到组织损伤和炎症部位，MSCs到达受损组织细胞后可以合成并释放较多生物活性分子，如抗炎细胞因子、营养和生长因子、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子以及干细胞因子等，这些因子可以参与受损组织的免疫调节，拮抗局部的炎症反应，同时激活受损组织的内源性修复机制^［17］；MSCs具有神经保护、神经发生和突触发生的作用，可以分泌促进神经存活和发生的生长因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子等维持突触的可塑性，进而促进局部再神经化恢复突触递质释放，并重建神经系统功能的传入和传出^［18］。

大量研究表明，MSCs在多个医学学科领域发挥重要的作用，已有基础和临床研究显示MSCs在治疗ASD方面具有一定潜力。在动物实验研究方面，目前广泛接受的BTBR近交系ASD小鼠模型表现出类似ASD的行为和神经解剖学异常，包括胼胝体缺失和海马连合减少^［19］，此外，还表现出脑源性神经营养因子信号传导的减少^［20］。Segal-Gavish等^［21］通过将人MSCs移植入BTBR小鼠模型中发现，小鼠刻板行为减少、认知和社会行为改善，且与假手术处理的小鼠相比，组织分析显示MSCs移植小鼠的海马脑源性神经营养因子蛋白水平升高，同时海马神经发生增加。进一步研究显示，将MSC-NTF（体外诱导定向分化为能分泌更多神经营养因子的MSCs细胞）移植入BTBR小鼠模型中显示出更为长久的疗效^［22］。除BTBR小鼠模型外，还有丙戊酸（valproic acid，VPA）诱导的ASD小鼠模型，Ha等^［23］研究了人类脂肪干细胞（human adipose stem cells，hASCs），其为一种从脂肪组织中分离的自体MSCs，对丙戊酸诱导的ASD小鼠模型的治疗作用，结果显示hASCs移植可以改善VPA诱导的ASD小鼠的核心症状，如社交互动减少、焦虑情绪以及重复行为等。

在临床研究方面，研究者探索了人脐带血单个核细胞和脐带血MSCs联合移植对治疗ASD的安全性和有效性，结果显示与单纯的康复训练组的患儿相比，MSCs移植组患儿具有一定的疗效，而联合移植组比单纯的MSCs移植组具有更好的疗效。在安全性方面，通过静脉和鞘内输注的干细胞耐受性良好，在24周的随访期间没有发现明显的副作用^［24］。Sharma等^［25］对32例儿童和成人ASD患者进行含有MSCs自体骨髓单个核细胞的鞘内注射，在之后26个月的随访中大多数患者在社会关系、情绪反应、沟通和行为等方面都得到了临床改善。这些研究结果表明MSCs在治疗ASD方面有一定的潜力和优势，但目前尚无统一的操作方法，如具体的干细胞选择、移植方式等，而且长期应用的疗效和安全性尚未明确，因此，仍需更多进一步的临床研究证实。

尽管大量的文献报道MSCs治疗方法较为安全，但使用大剂量的MSCs时仍可能出现一些不良反应。比如微血管闭塞、移植细胞转化为不适当的细胞类型、发生肿瘤和心律失常等副作用，且在出现不良反应时无法移除移植细胞^［26］。近些年，有研究显示MSCs的免疫调节和神经保护等作用依赖于其细胞来源的生物活性因子，如脂质、蛋白质（酶、细胞因子、趋化因子、免疫调节蛋白、营养因子和生长因子）、微小RNA（microRNAs，miRNAs），这些生物活性因子可以有效调节免疫反应，诱导新血管生成，促进受损神经元的修复和再生^［27］。而这些生物活性因子被包含在MSC-Exos中。MSC-Exos是MSCs分泌的细胞外囊泡，相较于活细胞治疗的MSCs，只有纳米大小的非细胞MSC-Exos体积小易储存，更容易穿透组织到达靶细胞，并且不会阻塞微血管系统，不会转变为不合适的细胞类型，也不会在停止治疗后作为永久性移植物持续存在，可大规模生产应用于临床治疗^［28］。既往已有相关研究表明，外泌体可能作为早期精神障碍诊断的生物标志物，并且外泌体miRNA可能成为未来精神障碍治疗发展的药物靶点^［29］，这些都提示MSC-Exos可能成为ASD的一种潜在生物治疗手段。

关于MSCs-Exos治疗ASD的病理生理机制尚未完全阐明，作为MSCs衍生的外泌体，MSCs-Exos除了具有MSCs所具有的免疫调节及神经保护作用外，还可能通过以下机制实现对ASD的治疗：首先，从细胞分子学角度MSCs-Exos可能通过调节ASD患者外周循环失调的巨噬细胞极化为抗炎M2样状态，使M2型巨噬细胞能够调节炎症因子达到外周抗炎作用^［30］。此外，MSC-Exos可以表达CD₂₉、CD₄₄和CD₇₃等几种黏附分子，它们能够促使MSC-Exos迁移到发炎和受伤的组织，通过与质膜融合将其内容物递送至靶细胞的胞质，从而调节受损组织的表型和功能^［31］。其次，从蛋白质组学角度，MSCs-Exos中存在血管内皮生长因子C、血管生成素-2和成纤维细胞生长因子-2，这些因子能够促进新血管生成，进而可能调节ASD患者紊乱的大脑微环境^［32］。最后，从基因组学角度，微阵列和质谱数据分析鉴定了MSC-Exos中4 850个基因产物和4 150个miRNA，其中miR-146和miR-21可能会改变神经和免疫细胞的表型、功能和活性，miR-143与MSC-Exos的免疫调节作用有关，miR-10b与MSC-Exos的迁移能力有关，此外，MSC-Exos中高度表达的多种miRNA能够调节细胞周期进程和增殖（miR-191、miR-222、miR-21）并调节血管生成（miR-222、miR-21）^［33］，因此MSC-Exos在治疗免疫性疾病及神经炎性疾病中有至关重要的作用。

已有相关研究将MSC-Exos应用于自身免疫性疾病以及神经认知障碍性疾病的治疗中^{［33, 34］}。而关于MSC-Exos治疗ASD只有少数的报道，且大多数仍停留在动物实验阶段。Perets等^［35］的研究表明通过鼻内给药，采用MSC-Exos治疗的BTBR小鼠在社交互动领域、社交沟通领域和重复行为方面表现出显著改善。同时，为了研究MSC-Exos给药是否对具有特定突变的转基因ASD模型也有效，研究者还选择Shank3B基因敲除的小鼠作为研究对象，结果显示同样可以改善ASD模型小鼠的核心ASD样行为^［36］。总之，相较于MSCs，无细胞治疗的MSC-Exos具有更大的优势，但尚缺乏可靠的临床前及临床试验，其中的机制也尚未完全阐明，这可能是今后研究干细胞治疗ASD的方向。

综上，目前关于ASD的发病机制尚不明确，越来越多的研究表明免疫相关因素在ASD的发病机制中起到了至关重要的作用。MSCs因其具有免疫调节及神经保护作用，可成为ASD的一种潜在生物治疗手段。而MSCs的治疗效果主要是通过其包含重要分子信息的外泌体介导的，除了具有MSCs所具有的免疫调节及神经保护作用外，MSC-Exos还可以调节外周巨噬细胞抗炎状态的改变及释放多种因子促血管生成改善大脑微环境，且进一步的基因分析发现其各种功能在基因产物和miRNA上的表达。相较于MSCs，无细胞治疗的MSC-Exos具有更多的优势，且对ASD的疗效也在一些动物实验中得到了肯定。

虽然MSCs-Exos治疗ASD的初步研究已经得到了一定的进展，但仍存在以下局限性：首先，目前对ASD复杂的病理生理机制仍不清楚，MSC-Exos是否在除ASD免疫炎症机制外的其他方面发病机制中发挥作用仍未可知。其次，研究仍处于理论和实验阶段，缺乏大量的动物实验和临床试验。最后，MSC-Exos长期应用的安全性还需要大量的研究验证，包括给药途径、单次剂量以及干预年龄等临床转化的问题仍需进一步研究和探讨。