上海市部分地区儿童A群链球菌感染分子流行病学及药物敏感性分析

目的

探讨上海市梅陇地区儿童A群链球菌(GAS)感染的流行状况及药物敏感性，为临床防治提供依据。

方法

回顾性研究。对2014年5月至2015年4月期间上海市徐汇区大华医院儿科患者咽拭子标本1 069例中分离培养的A群链球菌，使用分子生物学方法对菌株进行emm、MLST和PFGE等流行病学分型和进化分析，并使用K－B法对部分菌株进行药敏试验。分析不同季节、不同年龄人群的GAS感染特征、流行趋势和药物敏感性。

结果

共检出274株A群链球菌，阳性率为25.63%。emm分型中主要流行株为emm1型(38.83%)、emm12型(52.75%)，其他emm型别合计占8.42%。MLST分型主要为ST－28、ST－36和ST－49。emm分型、MLST和PFGE分子分型结果密切相关，其中emm1/ST－28、emm12/ST－36、emm75/ST－49等相互关联，相同的emm分型大多为PFGE分型的同一簇。本研究期间GAS感染的人群在3～13岁之间，6～11岁为高发年龄。GAS感染的高峰时间为2014年5至6月、2014年11月至2015年1月和2015年4月。该地区A群链球菌对青霉素、氨苄青霉素等β内酰胺类抗生素和左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺敏感性为100%，克林霉素、红霉素和四环素的耐药率大于95%。

结论

上海市梅陇地区GAS感染分型以emm12型为主，感染患者年龄主要在6～11岁，流行季节主要为冬春、初夏，β内酰胺类抗生素为首选抗菌药物。(中华检验医学杂志，2017, 40：362－366)

A群化脓链球菌(group A Streptococcus pyogens, GAS)又称为化脓链球菌(Streptococcus pyogens)，是链球菌中致病性较强的一种细菌，可引起不同类型的感染，如一些非侵袭的感染如咽喉肿痛和严重的侵袭性疾病如链球菌中毒休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)、坏死性筋膜炎(necrotizing fasciitis，NF)、严重的脓毒症^[1,2]等，是儿童急性扁桃体炎、咽炎、猩红热等的主要致病菌^[3]，部分菌株感染可引起严重的并发症如风湿热/风湿性瓣膜性心脏病和急性肾小球肾炎等^[4]，为了解上海市梅陇地区儿童呼吸道感染的A群链球菌流行及对常用药物的敏感情况，为感染控制和治疗提供有价值的临床流行病信息，对2014年5月至2015年4月上海市徐汇区大华医院儿科咽拭子分离的A群链球菌的流行情况及分子分型结果和药物敏感试验结果进行分析。

材料与方法

一、菌株来源

2014年5月至2015年4月间上海市徐汇区大华医院儿科门诊疑似上呼吸道感染患者1 069例，年龄在1～14岁之间，其中男性597例，女性472例。收集咽拭子培养标本，分离培养GAS阳性菌株共274株。所有菌株均杆菌肽试验敏感和使用生物梅里埃公司VITEK 2 Compact GP卡鉴定为A群链球菌，菌株甘油肉汤－80 ℃保存备用。

二、主要试剂

血平板、麦康凯、巧克力平板和加羊血的M－H平板等由上海伊华医学科技公司提供，PCR引物合成由上海生工公司合成，杆菌肽、克林霉素、红霉素、头孢噻肟、氨苄青霉素、青霉素、头孢吡肟等药敏纸片为英国OXOID公司产品。

三、方法

1．细菌DNA提取：

保存的菌株接种血平板37 ℃ 5% CO₂培养过夜，参照美国疾病预防控制中心网站( www. cdc.gov /ncidod /biotech /strep /protocol－emm－type.htm)推荐方法进行：在平皿上用无菌接种环刮取少量菌苔，加入300 μl生理盐水，70 ℃水浴15 min；5 000 r/min(3 500×g) 5 min离心弃上清，加50 μl TE、溶菌素( 3 000U/ml) 10 μl 、透明质酸酶( 30 mg /ml) 2 μl，混匀后37 ℃水浴30 min; 100 ℃煮沸10 min，离心取上清即为基因组DNA，－20 ℃保存待用。

2．emm分型：

根据美国CDC(www2a.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocol_emm－type.htm)的emm分型操作规程推荐设计引物，emm F(5′－3′)：TATT(C/G)GCTTAGAAAATTAA；emm R(5′－3′)：GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT，进行PCR扩增，委托上海生工公司对PCR产物进行纯化和测序，序列提交美国CDC网站进行比对，获得相应emm分型。

3．药敏试验：

菌株接种血平板37 ℃ 5% CO₂培养过夜，使用生理盐水调整菌液浓度为0.5麦氏单位，接种加羊血的M－H平板，5% CO₂ 37 ℃培养24 h，观察结果。对红霉素耐药和克林霉素敏感的菌株，进行D试验，验证是否为诱导耐药。药敏结果判断标准为CLSI M100 S25，质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619。

4．多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)：

根据http：//Streptococcus pygenes.mlst.net/网站推荐的引物序列和反应条件，合成化脓链球菌基因组上的7个管家基因(gki、gtr、muri、muts、recP、xpt、yqil)的上下游引物，进行PCR扩增，委托上海生工公司对PCR产物进行纯化和测序，测序结果使用Lasergene进行处理，然后在http：//Streptococcus pygenes.mlst.net/网站专用数据库进行比对，得到ST分型结果。

5．脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE):

菌株接种血平板37 ℃ 5% CO₂培养过夜，经过蛋白酶K处理、在金胶块中裂解，使用限制性酶切酶SmaI 37 ℃ 3 h。DNA片段用美国CHEF MAPPER System脉冲凝胶电泳，条件：6V/cm，14 ℃，脉冲角度120°，脉冲时间4～40 s，时间20 h。

6．统计学分析：

使用SPSS13.0进行数据统计处理。计数资料以百分率表示，比较采用χ²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同年龄和不同时间的阳性率比较

1．不同年龄阳性率：

1岁、2岁和14岁送检标本分别为18份、39份和7份，没有分离到阳性菌株；3～13岁的送检标本为18～203份，阳性率为4.88%～45.87%；阳性率较高的是6岁、11岁，分别为25.0%、45.87%，阳性率较低的是3岁、5岁、13岁，分别为4.88%、16.04%和11.11%。

2．不同分离时间的阳性率：

分离的阳性菌株按照时间分析，全年都分离到阳性菌株，阳性率为9.3%～36.97%。阳性率较高的是2014年5月、6月、12月和2015年1月、4月，阳性率分别为26.67%、26.71%、36.88%、31.39%和36.97%，阳性率最低的为2014年7月～10月，阳性率为9.3%～11.36%。

二、药物敏感试验结果

147株药敏标本来自猩红热患者、A群链球菌反复感染者和咽喉炎、扁桃体炎等上呼吸道感染者，菌株对氨苄青霉素、青霉素、头孢噻肟等β内酰胺类抗生素和左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺全部敏感，氯霉素的敏感率为87.08%，四环素的敏感率为3.04%，克林霉素、红霉素敏感率为1.36%，对红霉素耐药、克林霉素敏感的菌株进行D试验，D试验结果阴性。

三、分子流行病学分析

1．emm分型：

共分离到274株阳性菌株，可进行emm分型的273株，1株未能分型，其中emm1型为38.83%(106/273)，emm12型为52.75%(144/273)，其他为8.42%(23/273)，emm12型为最多，emm1型次之，其他分型较少。emm12型中主要亚型为emm12.0、emm12.19、emm12.76等，emm1型中主要亚型为emm1.0、emm1.18、emm1.65和emm1.76等，其他型别中主要包括emm75.0、emm170.0、emm89.0、stG245.0等。

2．MLST分型和PFGE分型：

对emm分型结果进行深入研究，选取分离自猩红热患者和A群链球菌分离反复阳性的患者共78株，主要分型为emm1型36株、emm12型38株和emm75型4株，采用MLST分型和PFGE分型进行流行克隆分析。MLST分型检测到ST－28(36株)、ST－36(38株)和ST－49(4株)3种分型，与emm分型对应关系为emm1/ST－28、emm12/ST－36和emm75/ST49。

PFGE分型结果与emm分型、MLST分型结果相对应，以80%相似为一个簇，共分为A－G 7个簇，其中A型为33株，主要为emm1型，D型为36株，主要为emm12型，不同簇间亲缘关系见图1。

注：Key：标本号；emm type：emm分型；Seqence type：ST分型；PFGE clust：PFGE分簇

综合分析，2014年5月至2015年4月上海市徐汇区大华医院儿科患者中A群链球菌存在流行克隆株，主要为emm1/ST28/A和emm12/ST36/D型。

讨论

A群链球菌是引起急性扁桃体炎、咽炎、猩红热等的主要致病菌，部分菌株感染可引起严重的并发症如风湿热/风湿性瓣膜性心脏病和急性肾小球肾炎等，这些疾病的产生可由不同型别的菌株产生，目前GAS的分型主要有emm分型、MLST分型、血清分型、PFGE分型等。M蛋白GAS细胞壁的蛋白抗原成分，由M蛋白基因(encoding mature M protein gene, emm)编码，其3′端为保守序列，5′端为高度可变区域，根据这一特点将GAS分成不同的emm基因型及亚型，是GAS的主要分型依据，目前已发现170个emm基因型和750多个emm亚型。各地区的emm基因型各不相同，并随时间的推移而发生变化，台湾主要为emm4、emm12、emm1和emm22^[5]，日本为emm1、emm89、emm12等^[6]，中国内陆报道1993至1994年主要为emm1、emm12和emm3，其次为emm4、emm6等，2005至2006年emm1和emm12为主要流行型^[7,8]，在欧洲，主要流行基因型为emm1、emm28、emm89和emm77等^[9,10]。

目前，国内A群链球菌的流行病学报道主要为疾病控制中心和三级专科医院^[7,11]，基层医院报道的不多，因此，对二级医院及以下等基层医院的儿童A群链球菌感染情况了解甚少。国家卫生计生委在各级医院推行分级诊疗，常见病、多发病的诊疗在基层医院，三级医院专注于疑难病症。本研究中的上海市徐汇区大华医院为一所二级综合医院，患者主要来自梅陇周边的社区，人群相对固定，儿童A群链球菌感染引起的上呼道感染等疾病是儿科门诊的常见病，对该地区GAS菌株进行分子流行病学分析，可反映社区儿童链球菌感染的状况，是对医院相关性感染流行病学信息的补充。了解本地区的常见病、多发病的流行规律，可提高医院诊疗水平，留住大多患有常见病的患者，将卫计委分级诊疗的要求落到实处。本研究表明，上海市梅陇地区2014至2015年少儿感染GAS的emm分型以emm12和emm1型为主，与国内的报道相似^[7,11]，但emm12型已超过emm1型成为主要型别。MLST分型和emm分型结果相关，主要表现为emm1/ST28、emm12/ST36和emm75/ST49等。

PFGE分型主要是分析同种菌株的同源性，实验结果显示，PFGE的分型与emm分型、MLST密切相关，相同emm分型的同源性很高，大多为一个簇，不同emm分型的同源性较低，为不同的簇，其中A型(33株)为emm1型、D型(36株)为emm12型，表明梅陇地区在2014年至2015年间有分型为emm1型和emm12型的克隆株局部流行。

本研究中年龄分析显示，1～2岁和14岁的患者没有分离到阳性菌株，6～11岁人群阳性率最高，均超过25%，小学生阳性率最高，其次是幼托儿童，这可能与该群体处于生长发育阶段，自身免疫系统尚不完善，抵抗力较低，同时，学校和幼托机构人员密集，空气质量和流通性较差，群体活动较多，接触密切，GAS可通过呼吸道传播，如有传染源，可引起交叉感染，造成局部暴发流行。

发病季节分析显示，2014年5月至6月和2014年11月、12月至2015年1月出现两个高峰，呈现明显的季节特点，主要发病季节在秋冬和春夏交界的季节，与报道仅在4至6月为高发季节有所不同^[11]，这可能与上海的气候因素有关，上海在这两个时间段气温变化较大，是呼吸道传染病的高发季节，同时，也是学校开学时间，两者相互叠加，形成两个发病高峰。

药敏结果显示，A群链球菌对β内酰胺类抗生素和万古霉素、利奈唑胺、左氧氟沙星等高度敏感，克林霉素、红霉素和四环素等耐药率很高，和国内的相关报道类似^[12,13,14]，与东亚地区等的报道有所不同^[5,13,15]，推测可能与儿童社区呼吸道感染时阿奇霉素等大环内酯类抗菌药物的过多使用有关。因此，对A群链球菌的感染，β内酰胺类抗生素可作为首选的药物，如果对β内酰胺类抗生素过敏，为提高治疗的成功率，需根据药敏结果选用合适的抗生素。

目前，A群链球菌尚无有效的疫苗，管理传染源是预防感染的主要措施。在分级诊疗金字塔体系中，基层医院是塔基部分，主要预防、诊治常见病和多发病，其中包括常见的病原菌感染，因此，基层医院成为预防、诊治常见病原菌感染的第一线。了解本地区GAS感染的发病年龄、流行季节、分型情况和药敏结果等流行特点，可为疾病控制部门和学校幼托机构的防治提供依据。同时，医院可根据GAS流行情况，及时对疑似感染做出诊断，进行对症治疗，提高治愈率，减少并发症的发生。