液相色谱-串联质谱化学衍生技术在临床检验中的应用
2021年8月
中华检验医学杂志，第44卷第8期 第664页-第668页
王少亭,戴雯,李艳
近年来，液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术在我国检验医学领域得到广泛应用［1］。结合稳定同位素稀释（stable isotope dilution）策略，LC-MS/MS一般可提供比传统检测方法更灵敏、更准确的定量结果。但是，很多分析物存在离子化效率低、碎裂行为不佳、前处理/分析过程中易分解等问题，使其并不适合利用LC-MS/MS进行直接分析。为提升检测效率，化学衍生处理受到越来越多的关注。实际上，基于化学衍生建立LC-MS/MS检测方法的研究已有近40年的历史［2］，在我国开展较为广泛的维生素、激素、神经递质、治疗药物监测等定量项目的发展中已起到关键的推动作用。
理论上，化学活性越高的基团越容易进行衍生化处理。常见的可修饰基团包括：醇羟基、酚羟基、酮基、醛基、氨基、羧基、巯基、烯基等［3］。在方法学建立过程中，引入化学衍生技术将带来以下优点。（1）提升目标分析物稳定性：当目标物在前处理和分析过程中易分解时，我们设计衍生化反应，对其活性中心进行稳定化修饰，从而保障检测过程的精密度和准确度［4］。（2）提升目标分析物的质谱响应：当目标物缺乏可带电的结构单元或在质谱中难以形成特征碎片离子时，我们通过衍生化反应引入易带电或有良好碎裂行为的基团，从而改善待测物的检测灵敏度［5］。（3）改善目标分析物的色谱行为：当目标物在常规分离模式（疏水、亲水）下保留较弱时，可以通过化学衍生引入特定基团提高保留强度；当分离手性化合物时，可通过对手性中心上官能团的修饰，放大手性异构体空间结构上的差别，从而获取更好的色谱分离效果［6］。（4）合成稳定同位素内标：当目标分析物的稳定同位素内标尚未实现商品化时，可通过使用含有稳定同位素的衍生化试剂合成衍生化产物，间接利用其作为稳定同位素内标，从而保障稳定同位素稀释法的顺利实施［7］。
目前，对维生素D的检测是我国临床质谱平台的工作重点之一［8］。然而对于特殊人群（如婴幼儿人群），常规的静脉采血会对受试者及其家属造成严重的生理/心理负担。所以在手指血或干血斑等微量化标本中实现相关生物标志物的定量具有重要的临床价值。但是，由于25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的质谱响应较差、且浓度相对较低，使得如何提升检测方法灵敏度成为关键科学问题。为此，多种衍生化策略已被设计并应用。其中，针对共轭双烯结构的Cookson-type衍生化方法研究最为充分。该反应由Cookson等［9］于1962年提出，并于1993年由Wilson等［10］引入质谱衍生化领域。通过改变“R”基团的种类可得到PTAD试剂（4-phenyl-1，2，4-triazoline-3，5-dione）、DAPTAD试剂［4-（4-dimethylaminophenyl）-1，2，4-triazoline-3，5-dione］、Amplifex diene试剂、离子液体试剂［12-（maleimidyl）dodecyl-tri-n-butylphosphonium bromide］等［11］。与直接检测相比，Cookson-type衍生化能提升检测灵敏度100~1 000倍。但是，由于在发生Diels-Alder 加成反应的过程中，Cookson-type试剂会随机从α-和β-方向进攻共轭双烯，所以最终生成的产物会以空间异构体的混合物形式存在，这为后续的色谱分离提出了额外的要求。同时，相关反应一般需要较长的孵育时间和较高的反应温度，使其暂时难以匹配高通量检测的需求。近年来，亦有多种新型衍生化策略被相继提出，但是相关方法均存在各自的缺陷。例如，Wan等［12］改良了对共轭双烯的反应，利用PyrNO（2-nitrosopyridine）实现比Cookson-type试剂更高效的“点击”衍生化。但该反应甚至会形成4个空间异构体，严重影响了色谱分离效率。Le等［13］则通过使用异烟酰氯（isonicotinoyl chloride）对维生素D的环上羟基进行酰基化反应，在显著提升分析物质谱响应的同时，有效避免了形成空间异构体的困扰。但是，由于在有机溶剂中溶解度有限，该衍生化试剂仅能以饱和溶液形式现配现用，且使用过程对环境温湿度要求较高，故难以在常规临床实验室有效推广。所以，针对维生素D相关代谢物的衍生化方法仍有待进一步完善，建立反应效率高、基质效应低、可应用性强的化学衍生策略将对相关临床及科研领域的发展起到重要的推动作用。
2015年1月起，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism开始仅接收由质谱法检测性激素的临床研究［14］。自此，质谱平台正式取代传统免疫平台成为性激素精准检测的关键。虽然随着仪器性能的提升，近期已有一些定量限可达pg/ml（1 pg/ml=1 ng/L）级别的直接检测方法学出现，但是对于大部分质谱方法学而言，化学衍生仍是不可或缺的前处理步骤［15］。对于雄激素和孕激素，衍生化反应一般针对羰基或环上醇羟基设计，包括羟胺类反应［16］、吉拉尔特试剂类反应［17］、酰氯类反应［18］等。对于雌激素，相关衍生化反应一般针对其酚羟基设计，例如丹磺酰氯类反应［19］和Sanger类反应［20］。这些反应均能通过向性激素分子上引入带正电的基团，从而提升其质谱检测灵敏度。近年来，随着“甾体组学”的提出，为满足对多种类型激素的同时分析，研究者已开始有序结合不同的衍生化策略处理同一份样品。例如Qin等［21］利用甲氧胺和丹磺酰氯平行衍生化羰基和酚羟基，最终实现对包括雌激素、雄激素、孕激素、皮质激素等29种激素的同时检测。然而，由于激素类物质在体内有众多的结构类似物，当多反应监控模式下子离子选择衍生化试剂的特征碎片时，在色谱分离过程中很容易遭遇假阳性干扰。此外，在衍生化反应后，体系中往往留存大量与色谱分离和质谱离子源不匹配的杂质（例如丹磺酰氯衍生化反应后溶液呈碱性，易腐蚀色谱填料；同时，体系中含有碳酸钠等非挥发性成分，会堵塞电喷雾离子源），所以如何建立高效的纯化策略亦是相关领域一直以来研究的重点［22］。
儿茶酚胺代谢通路上的生物标志物大部分含有氨基或邻苯二酚结构单元，其化学性质不稳定，且色谱分离难度较大。目前主要的衍生化策略包括：使用苯甲酰氯类试剂［23］或酸酐类试剂［24, 25］同时修饰氨基和酚羟基；使用异硫氰酸酯类试剂［26］修饰氨基；使用苯硼酸类试剂［27］修饰邻苯二酚基团等。这些反应均可提升分析物的疏水性，改善在C18等色谱柱上的分离效率。同时，大部分衍生化试剂均会修饰酚羟基，从而有效避免分析物在前处理和色谱分离过程中被氧化。例如，van Faassen等［24, 25］利用丙酸酐进行基质内衍生，相继实现了对多巴胺代谢通路上色氨酸相关吲哚类物质和儿茶酚胺类物质的高灵敏检测。在前处理过程中，丙酸酐不仅起到衍生化试剂的作用，还通过水解产生丙酸，促进血浆基质内蛋白的变性，进而显著简化了操作流程。近期，Richard等［26］使用苯基异硫氰酸酯作为衍生化试剂，实现了对血斑中3-甲氧基肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-羟色胺的同时检测。其方法学最低定量限达到40 pg/ml，有助于早期诊断嗜铬细胞瘤和神经节瘤。但值得关注的是，目前针对儿茶酚胺的衍生化试剂均具备较强的腐蚀性和生物毒性，在操作过程中易造成潜在的实验室污染，这严重影响了相关方法在常规医学检验实验室中的推广。所以如何发展相对绿色的衍生化策略，从而提升方法学的可应用性，是未来研究的重点。
实际上，化学衍生技术除了帮助实现儿茶酚胺代谢路径中各产物的准确定量外，对通路启动阶段所涉及的辅酶四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4，参与催化酪氨酸合成左旋多巴）的检测亦起到关键的作用。BH4的5号位仲氨基具备很强的还原性，导致其在前处理及色谱分离过程中易被氧化分解，所以长期以来主要采用非特异性碘氧化的方法对其进行间接定量［28］。该方法处理过程复杂，且检测特异度和灵敏度难以达到临床应用标准。近期，Yuan等［29］提出利用苯甲酰氯特异性衍生化BH4活性中心的策略。通过生成酰胺键，显著提升BH4的稳定性，最终首次实现了对血浆中内源性BH4的质谱定量分析。但是，关于此类辅酶的化学衍生方法仍存在诸多缺陷，例如，经过苯甲酰氯衍生化后，体系中存在大量苯甲酸难以高效清除；尚缺乏能有效稳定化醌型二氢生物蝶呤的化学衍生策略等。这些问题尚有待后续研究予以进一步完善。
对于大多数治疗药物监测项目，LC-MS/MS平台可满足直接定量分析的需求。但是对于一些特殊的药物及其代谢物，化学衍生仍是实现准确定量的前提。在抗癌治疗药物监测方面，Shu等［30］采用丹磺酰肼对4-羟基环磷酰胺进行衍生化、提升其化学稳定性，进而实现了对环磷酰胺的药物基因组学研究。Liu等［31］比较了丹磺酰氯、重氮甲烷、对溴苯甲酰溴对S-1化疗药物治疗过程中涉及的多种关键生物标志物的化学衍生效果，并最终选择对溴苯甲酰溴作为衍生化试剂，实现了对喃氟啶、吉美嘧啶、5-氟尿嘧啶和尿嘧啶的LC-MS/MS同时定量检测。在抗癫痫治疗药物监测方面，Duhamel等通过使用邻苯二醛和乙酰基半胱氨酸作为联合衍生化试剂，建立了快速检测不同空间构象的γ-乙烯氨酪酸的方法学，并成功应用于对4岁以下患者的药代动力学研究中［32］。总体而言，随着个体化用药的深入开展，大量药物代谢中间体被证实具备重要的临床价值。由于这些生物标志物往往浓度低、易分解，所以化学衍生技术在未来治疗药物监测的相关研究中无疑将扮演越来越重要的角色。但值得注意的是，由于治疗药物监测项目普遍对方法学检测通量有较高的需求，而衍生化反应的引入会不可避免的延长前处理的周期，所以进一步设计反应效率更高、处理步骤更简单的衍生化方法将是相关领域未来的工作重点。
随着质谱平台在我国医疗机构的进一步普及，化学衍生技术的发展成为必然趋势。如前所述，对于特定的项目，该技术能显著提升定量水平。但同时不可忽视的是，衍生化反应的引入亦将对方法学的建立造成一些不利影响，主要包括：（1）衍生化产物的降解问题；（2）过量的反应物和生成的副产物会带来潜在的基质效应；（3）苛刻的反应条件和冗长的孵育时间会影响方法学通量；（4）额外化学试剂和有机溶剂的使用会加重实验室污染；（5）处理步骤的增加容易降低定量精密度和准确度，从而提升质量控制的难度。针对上述问题，从业人员需要在方法学建立和实施过程中做更多的工作，例如，（1）除了考查目标化合物在衍生化前的稳定性外，其衍生化产物在储存与分析过程中的稳定性亦需系统考查；（2）需要适当的使用固相萃取、液液萃取等方法纯化衍生化产物，或引入快速、简单、便宜、高效、可靠、安全（QuEChERS）等技术去除体系中的杂质［33］，从而最大程度上降低基质效应对定量的影响；（3）设计温和、高效的衍生化路径，在保障反应产率的前提下，尽可能提升化学衍生的通量；（4）避免采用高毒性的衍生化试剂，从而降低实验室污染，保障衍生化方法的可应用性；（5）与常规直接检测方法相比，虽然化学衍生的加入并不会带来质控规则的改变，但失控后的原因分析和结果处理过程无疑将更加复杂，从业人员需要额外关注化学衍生过程涉及的各个要素（包括衍生化试剂是否变质、反应环境和条件是否改变等）方能准确解决相关质控问题。总体而言，只有在合理设计衍生化方案、系统优化反应条件、全面评估反应效率，适当引入纯化方案、持续关注质量控制的前提下，化学衍生技术才能真正发挥其优势，达到提升LC-MS/MS方法检测效果的目的。
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