晚期糖基化终末产物的研究现状
2022年4月
中华检验医学杂志，第45卷第4期 第337页-第342页
韩丽乔,严君,张乔轩,黄宪章
晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）是体内蛋白质、脂质或核酸类大分子暴露于还原糖中生成的一组复杂的异质性物质［1］。AGE在体内随着糖尿病、衰老等发展过程不断生成和蓄积，直接或间接与细胞表面的受体结合而发挥细胞毒性作用。大量研究表明AGE水平与（糖）代谢性疾病的病程高度相关，且在这些疾病的病理机制中发挥重要作用［2, 3, 4, 5, 6］，可能是潜在的生物标志物。但由于AGE的种类繁多，其确切结构和化学性质还未完全清楚，同时分离和检测技术的限制使AGE的准确定量存在很大挑战，也为AGE在科研和临床应用中带来障碍。本文对AGE的生成、结构与分类、临床检测价值、检测方法现状以及准确定量面临的挑战进行论述，以促进AGE灵敏、特异的检测方法的开发建立，为相关疾病的研究以及临床诊断提供基础。
AGE是在非酶促条件下，体内葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基，在体内经过系列反应生成的不可逆终末产物［1］（
与蛋白结合的AGE目前研究最为广泛。根据AGE与蛋白结合的存在形式，常分为结合型及游离型［7］。结合型AGE是指通过与蛋白的氨基酸残基交联生成的复合物，通常也称为AGE残基［8］。结合AGE交联在蛋白上的残基经过体内单核巨噬细胞等处理过程被降解为游离肽和氨基酸，游离的氨基酸与羰基化合物生成的小分子物质即游离型AGE，也称为AGE游离加合物［9］。蛋白的糖基化修饰位点主要发生在赖氨酸（Lys）及精氨酸（Arg）残基上［10］、少部分发生在半胱氨酸（Cys）及组氨酸（His）残基上［11］，根据糖基化位点的不同，蛋白来源的AGE常分为Lys衍生型、Arg衍生型、Lys-Arg交联衍生型、Cys衍生型及His衍生型AGE［12］。
文献已报道了具有确切结构的AGE［13, 14］，但由于AGE结构和种类的多样性，以及目前分离和鉴定技术的限制，AGE的确切结构和化学性质还不完全清楚。蛋白来源的AGE，按照有无荧光特性又分为2类，一类是由1种Amadori产物与多种糖酵解产物缩合而成，缺乏荧光性，如N-（羧甲基）-赖氨酸（carboxymethyl-lysine，CML）、吡咯素等；另一类是由2个Amadori产物缩合而成，为棕褐色，具有蛋白特征性荧光光谱［15］，乙二醛-赖氨酸二聚体（glyoxal-lysine dimer，GOLD）、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体（methylglyoxal-lysine dimer，MOLD）、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体（deoxyglyoxal-lysine dimer，DOLD）和PEN（pentosidine）等，这类AGE则可利用其荧光特性进行定量检测。
脂类来源的AGE是由脂质氧化或代谢产生的氨基化合物与活性羰基化合物反应生成的晚期脂质化终产物（advanced lipoxidation end products，ALE）［16］，膜磷脂如磷脂酰乙醇胺在高血糖条件下可经糖基化修饰生成脂源性AGE，主要包括羧甲基磷脂酰乙醇胺和羧乙基磷脂酰乙醇胺等。
核酸来源的AGE经糖基化修饰后可直接影响基因的转录与表达，关于其具体化学结构文献中鲜有报道。
AGE的累积与（糖）代谢性疾病的发生机制还未十分明确，但已有大量研究表明，即使刺激因素已纠正，AGE也不会转变为正常物质，而是持续性的累积，进而影响疾病进程［17, 18］，尤其在糖尿病及其并发症的发生发展中发挥了重要作用。其累积速度/水平的检测对相关疾病的诊断具有重要指导价值。
1.AGE在糖尿病及其并发症中的临床检测价值：糖尿病患者由于长期慢性高血糖，AGE形成速度加快，即使当高血糖已纠正时，水平亦明显高于健康人群。Hanssen等［19］在1项12年的随访研究中揭示：1型糖尿病患者中升高的甲基乙二醛水平使心血管事件的发生率增加了1.47倍。吴怡琪和卢文［20］用荧光光谱法检测糖尿病患者皮肤AGE，发现并发糖尿病肾病患者的皮肤AGE高于单纯糖尿病患者，且皮肤AGE含量随着糖尿病肾病的进展而升高。Li等［21］研究表明糖尿病骨质疏松症组的脂肪和骨骼组织中AGE明显增加，且对照组的脂肪干细胞比AGE治疗组的增殖活性更高。Katagiri等［2］研究表明AGE的沉积可导致周细胞病变，与糖尿病患者的视网膜病变密切相关。Vouillarmet等［5］的研究表明糖尿病足创面难以愈合与AGE的影响密不可分。Aubert等［6］研究2型糖尿病患者中糖基化水平与糖尿病周围神经病变发生的相关性，结果表明羧甲基赖氨酸及其可溶性受体独立于其他危险因素，导致周围神经病变的发生率为20.7%，但与甲基乙二醛氢咪唑啉酮-1和戊糖苷素发生无显著相关性。可见，AGE与糖尿病并发症的发生高度相关，同时其蓄积浓度和生成速度会影响这些疾病的进程。
AGE在糖尿病及其并发症中的临床诊断中应用最多的是对患者皮肤中有荧光特性的AGE的检测［22, 23, 24］，如糖尿病足患者通过对其皮肤表面的自体荧光值监测而对病情进行监控，同时作为判断患者是否需要截肢手术的辅助指标［25］。血清中AGE的检测对于糖尿病及其并发症的诊断应用尚处于临床前研究阶段［26］。通过对大量临床样本中不同结构AGE的精准定量检测，有望筛选出某类AGE作为糖尿病及其并发症的早期预警指标、诊断指标或者是预后评估指标［27］。
2.AGE在其他疾病中的临床检测价值：近年来研究表明，AGE引起的氧化应激反应是导致相关疾病发生的重要因素。AGE与其受体RAGE结合后，可诱导产生大量氧自由基，从而激活核因子-κB途径，产生氧化应激。
心血管疾病如动脉粥样硬化，在AGE的作用下，细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生速率大于生成速率，ROS蓄积可直接灭活一氧化氮（NO），导致内皮功能失调，过多的ROS还可引起内皮功能损伤，启动炎症反应，从而导致动脉粥样硬化［4］。刘生源［28］通过分析62例冠状动脉粥样硬化患者血清AGE与冠状动脉钙化（CAC）的相关性，发现AGE水平与CAC评分成正相关（r=0.821），诊断CAC的受试者工作特征曲线下面积为0.821（P<0.001），血清AGE临界值为45.82 ng/ml时，诊断CAC的灵敏度为65.9%，特异度为90.5%。
在衰老相关性疾病如阿尔茨海默症（Alzheimer′s disease，AD）［29, 30］，AGE可诱导脑细胞产生过多的ROS，积聚的ROS可以导致β样淀粉蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积，导致老年斑的形成从而加速AD的进程。此外AGE还可与生物大分子及脂类生成脂褐素，脂褐素累积可干扰细胞的正常代谢，影响细胞功能并产生细胞毒性作用，从而加速机体老化过程。有研究表明AD患者脑脊液中，某些AGE如CML、MOLD、GOLD的变化与其认知功能呈高度相关，提示其可作为AD诊断标志物的可能［29］。
在恶性肿瘤中，AGE主要通过3种途径来促进肿瘤的进程［31］：（1）通过与关键蛋白发生非酶促交联作用改变细胞的结构与功能，例如通过将热休克蛋白27的精氨酸残基发生糖基化后阻止肿瘤细胞凋亡。（2）与RAGE受体作用激活下游的细胞增殖相关信号通路。（3）促进肿瘤细胞产生过多的ROS，而ROS有利于维持肿瘤微环境从而促进肿瘤的发生发展。
此外有研究［32］表明AGE也可作为非酒精性脂肪肝的疗效诊断标志物，通过对43例使用阿托伐他汀治疗非酒精性脂肪肝患者血清中AGE监测，发现患者血清AGE下降水平与临床治疗效果高度相关（r=0.62）。
以上研究均表明AGE的逐步生成累积过程提示了其作为上述疾病的早期预警、诊断及疗效监测指标的潜在可能。
目前AGE的常用检测方法包括荧光光谱法、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相-色谱串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、免疫荧光法（fluoroimmunoassay，FIA）、免疫组织化学法和放射免疫分析法（radioimmunoassy，RIA）等［13, 14，33, 34］。
荧光光谱法是利用某些AGE在特定激发波长下产生特征性荧光的原理进行检测。临床上多用于人体皮肤AGE检测，通过常温下特定波长范围的光源照射皮肤表面，从而实现非侵入式的皮肤自发荧光检测。Kellow等［35］研究表明健康成年志愿者的皮肤自发荧光值与年龄、吸烟、腰围和肉类产品的摄入量呈正相关，同时给出了不同年龄层次健康人群自发荧光值的参考范围。该方法使用装置简单，操作便利、无创。但灵敏度较低，仅可检测含有荧光基团的AGE，如CEL、GOLD、MOLD、DOLD、戊糖素、咪唑酮等；而其他没有荧光特性基团的AGE，如CML和MG-H等无法检测，会造成检测结果假性降低，同时该方法也易受到不同肤色、测试位置等因素的影响，限制了其广泛应用。
ELISA法是基于抗原抗体特异性结合的检测方法。仙娜等［36］用ELISA法检测发现孕妇血清中AGE的含量与重度子痫的发生率显著相关。Loomis等［37］发现，2型糖尿病肾病患者血清中AGE可激活下游AGE受体通路，从而提出检测AGE可初步筛选糖尿病肾病。然而由于一些AGE有相同的抗原决定簇，其抗原表位发生改变会导致检测结果假性降低，另一方面AGE可能会与非AGE修饰的结构发生交叉反应导致结果假性升高，同时不含该抗原表位的蛋白来源AGE和脂类来源的AGE不能检测。
HPLC法［13］可对不同极性的AGE混合物进行色谱分离，然后使用荧光检测器或紫外检测器进行检测分析，因此只能对AGE中特定的几种能发荧光或者紫外光的化合物进行检测，如吡咯素、N-（二甲基嘧啶）精氨酸、咪唑啉酮精氨酸、甲基咪唑啉酮精氨酸、3-脱氧葡萄糖酮、MOLD、DOLD、1-烷基-2-甲酰基-3，4-糖基吡咯等含有五元环结构的化合物，不能对总的AGE进行定量。同时人体生物样本组成复杂，含有其他能够发荧光或紫外光的化合物，若HPLC无法将其全部分离，则干扰方法的特异性。随着质谱技术的快速发展，高效LC-MS/MS对于小分子化合物的定量有着独特的优势，也用于AGE游离加合物的定量检测中［14］。该方法利用已知结构AGE游离加合物的特定质荷比，结合质谱的高分辨能力及色谱的高分离能力从而实现对小分子AGE游离加合物的定量，如CML、CEL、PEN、DOLD、GOLD、MOLD等。LC-MS/MS法分析速度快、灵敏度高、特异性好［38］。检测样本类型主要是血清/血浆和尿液。然而该方法前处理复杂，如何有效地从基质中提取AGE仍是一个难题。同时该方法还需AGE明确的分子结构，因而检测AGE种类和能力有限。另外与其他方法相比，如ELISA检测结果的表达形式不同，缺乏可比性。
FIA和免疫组化法均是基于抗原抗体和荧光发生原理，FIA法可对组织样本中AGE进行定性和定量分析，但也存在荧光干扰的问题。免疫组化法只能定性或半定量检测组织标本中的AGE，由于需要获得组织标本，操作过程繁琐，不适于临床推广。目前FIA和免疫组化法较多应用于AGE相关疾病的细胞培养和动物实验机制研究中［39］。RIA因存在同位素放射衰减以及放射危害的问题，已较少使用。
以上检测方法存在的局限性（非特异性反应、灵敏度不高、结果不准确），且只能检测某些特定类型或化学结构明确的AGE，无法检测所有或总AGE，严重影响了其临床应用［33, 34, 35, 36, 37, 38, 39］。
AGE的结构复杂，蛋白、脂质、核酸等来源广泛以及糖基化位点的多样性构成了种类繁多的AGE，AGE游离加合物分子量相对较小，结构明确，可进行准确定量［7，9］；而AGE残基为蛋白/核酸/脂质大分子，目前其结构并不清晰［8］，被测量也未能明确定义，难以买到成品标准物质，无法准确定量，这些都为AGE灵敏特异定量方法的开发带来巨大挑战。
目前应用最多的皮肤荧光检测方法［22, 23, 24, 25］，方便快捷且无创，但容易被荧光基团背景干扰，不够稳定特异，致命缺陷在于无法检测不具备荧光基团的AGE；免疫测定方法：ELISA、免疫组化法、FIA及RIA等采用的AGE多克隆抗体制备繁杂，约需数月［40］，首先用高糖诱导牛血清白蛋白（BSA）在4 ℃条件下反应约2个月生成AGE-BSA免疫原，在用该免疫原刺激动物获得抗AGE多克隆抗体，然后纯化制备成品。AGE-BSA多克隆抗体除存在抗原抗体交叉反应的缺陷外，仅代表体外高糖诱导牛白蛋白为主要来源的AGE混合物，因而ELISA和免疫组化法检测的AGE不能准确反映体内AGE的真实水平。同时外源性的AGE广泛存在，与体内自身的AGE结构相同或类似，各免疫测定方法均无法有效区分，难以准确定量［37］；质谱方法对于小分子化合物的定量灵敏特异准确，可对结构类似的化合物进行同步快速检测［38］，有望实现AGE游离加合物的群组检测，但对大分子绝对定量的优势不明显且前处理繁琐耗时，实现自动化检测任重道远。AGE的精准定量检测在目前的检测技术和方法上还存在很大的挑战。
AGE与糖代谢性疾病的发生密切相关，体内浓度的蓄积影响了疾病的进程，尤其是糖尿病相关并发症［5, 6，19, 20, 21, 22, 23, 24, 25］，然而由于其检测方法的限制，一直未能发挥临床作用。但即使建立了灵敏特异的检测方法，要在临床使用还需要建立相应的参考区间和临床决定水平。总之，新的标志物从发现到应用于临床，需要进行充分的实验研究和临床评价，需要科研工作者、临床医生、检验医师的各个层面专家的合作和共同努力。
由于AGE结构的复杂多样以及检测方法的落后，限制了其在科学研究上的进程和临床应用，尤其是糖尿病相关并发症，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变等一直没有灵敏特异的实验室诊断指标。我们可借助LC-MS/MS技术上的优势，以AGE小分子游离加合物为突破口，经过样本前处理，得到粗提纯的混合物，然后借助色谱的分离优势和质谱灵敏、特异的定量检测优势，实现AGE小分子游离加合物准确检测的可能，在此基础上对AGE残基大分子通过糖组学靶向定量研究，实现经特异位点酶切的特征片段的准确定量。如能实现AGE的有效分离和精准检测，则极有可能推动糖代谢疾病相关机制的研究进展，同时AGE也极有可能成为糖代谢相关疾病，尤其是糖尿病并发症的早期诊断标志物，造福广大患者。
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
[30]
[31]
[32]
[33]
[34]
[35]
[36]
[37]
[38]
[39]
[40]
收藏此内容
推荐给朋友