唾液外泌体的研究进展

唾液是主要由腮腺、颌下腺和舌下腺分泌的含多种物质的混合水溶液。唾液组学的研究涵盖了基因组学、转录组学、蛋白质组学、微生物组学、代谢组学及微小RNA （microRNA ，miRNA）等各个方面。这些研究不仅加深了对口腔相关疾病发生发展的认识，而且为该类疾病的诊断、治疗及预后提供了新的理论基础。唾液中外泌体（exosome ）自被发现以来即备受关注，研究多集中于生物分子标志物方面。

外泌体是直径30~120 nm、具有脂质双分子层结构的膜性微囊泡，由细胞膜内陷出芽融合多囊泡体，多囊泡体膜与细胞膜融合后，存在其内部形态大小均一的囊泡被释放到胞外空间^[1,2,3,4]。外泌体广泛存在于多种体液中，如血浆、尿液、羊水、腹水、乳汁、脑脊液等^[5,6,7]，同时研究证实唾液中也存在外泌体^[8,9,10]。外泌体来源不同，其生理功能也不相同，包括免疫调节、促进肿瘤生长浸润、凝血过程、介导细胞间交流等^[11]。下面将从唾液外泌体的特性、标本留取和分离、疾病联系及其应用前景进行综述。

一、唾液外泌体的生物学特性

Johnstone等^[12]在研究网织红细胞成熟过程中证实了外泌体的存在。经过近40年的研究，发现所有体外培养的细胞都能产生外泌体，而且在多种体液中也存在外泌体。唾液外泌体主要由大唾液腺和小唾液腺分泌，还有部分来源于口腔的定植菌群。

1．形态学：

在透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）下外泌体呈大小均一、直径30~120 nm的椭圆状或杯状脂质双分子层样结构，在免疫电镜下用胶体金标记的CD63抗体可观察到外泌体呈椭圆状，双层膜样结构，CD63分子分布于整个膜表面^[9,13]。全唾液经凝胶分离，膜孔过滤后发现有两种类似外泌体样颗粒，经证实两种均为外泌体，但在体积上却不相同^[14]。

2．分子组成：

唾液在口腔中起润滑、缓冲、抗菌及维持黏膜完整等生物学功能，而来源的外泌体在口腔中作用尚不清楚。在腮腺液体中利用多维蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology，MudPIT）对唾液外泌体进行蛋白质谱分析^[15]，发现存在491种蛋白质，其中大部分与腮腺导管液体中的蛋白质同源，说明腮腺导管上皮细胞是唾液外泌体的来源之一，此外还有部分蛋白质与尿液来源外泌体中的蛋白质同源，说明各种细胞源性外泌体之间具有相似性。外泌体的膜蛋白如CD9、CD63、CD81，胞内蛋白如热休克蛋白70 （heat shock protein 70，HSP70）、肿瘤敏感性基因101 （tumor susceptibility gene, TSG101）等被认为是外泌体的标志蛋白。有学者从唾液外泌体中鉴定出二肽基肽酶Ⅳ （dipeptidylpeptidase Ⅳ，DDP-Ⅳ）、半乳糖凝集素3 （galectin-3）、免疫球蛋白A （immunoglobulin A，IgA ）、多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor，pIgR）等^[8,14]，DPP-Ⅳ是一种内源性酶，其主要作用是分解胰高血糖素样肽1 （Glucagon-like peptide-1, GLP-1），GLP-1可以通过刺激胰岛素、抑制升血糖类的激素、抑制胃排空和使胰岛细胞重生的方式降低血糖，也为外泌体在调节血糖中的作用机制提供理论基础，而IgA在口腔固有免疫中发挥重要作用。

唾液外泌体中除含有蛋白质外，还存在mRNA及miRNA^[10,16]、细胞因子、转录因子受体等多种生物活性物质。在唾液外泌体中广泛存在miR-22、miR-202及特有的miR-1237d^[10]。miRNA是一类约为20~24个核苷酸长度的调节转录后基因水平表达的非编码RNA，广泛参与个体发育、细胞增殖、凋亡等生命活动。miRNA通过3'UTR （非编码区）与mRNA按照碱基配对原则结合，当完全互补时诱导靶基因mRNA降解，从而导致蛋白质不表达，不完全互补时可抑制mRNA的蛋白翻译^[17]。有研究表明，在血液和唾液中miRNA主要富集于外泌体中，从而可有效避免RNA酶的裂解^[10]。外泌体在形成过程中将miRNA"打包"装入膜内，应用现有的外泌体分离技术及反转录PCR （reverse transcription PCR, RT-PCR）扩增可以准确分析其含量，这将是一个分析miRNA的新手段。Hammond等^[18]报道Argonaute蛋白（Ago蛋白）家族成员可以与成熟的miRNA结合，一方面抵抗RNA酶的分解；另一方面可以激活RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RNA-RISC），与mRNA结合发挥生物学作用。miRNA无论是进入外泌体膜内还是与复合物结合都发挥着重要作用。

二、唾液的留取及外泌体分离

目前外泌体的分离技术主要有3种：超速离心法、沉淀法及膜超滤法^[16,19,20]。此外还有一些其他方法，如磁珠分离法、免疫法、亲和纯化法及微流控技术等^[21,22]。各种方法各有利弊，超速离心法分离的外泌体产量高，蛋白污染少，重复性好，但操作复杂，耗时耗力。沉淀法是一种基于化学试剂ExoQuick分离唾液外泌体的方法，唾液和ExoQuick在4 ℃下共同孵育后，可获得完整无损的外泌体。膜过滤法虽有着多样本同时操作、可节约大量的时间的优点，但由于膜孔易堵塞、蛋白污染多而较少采用。唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及其周围众多小腺体分泌的一种无色且稀薄的液体。唾液中水分占99%，富含多种蛋白质如ɑ-淀粉酶、黏蛋白、富组蛋白、免疫球蛋白、胱蛋白等。目前唾液标本的收集方式主要有全唾液和单一腺体。对唾液的研究是收集全唾液还是单一腺体分泌的唾液尚存争议，目前认为全唾液更为合理，虽然单一腺体分泌液体污染少、精密度高，但全唾液较单一腺体唾液含有更多有价值成分的物质，同时留取方便、安全、方法简单且广泛适用^[23]。在安静状态下，唾液主要来源于舌下腺和颌下腺，刺激状态下则主要来源于腮腺^[24,25]。因此对于口腔不同部位病变，采集相应病变的腺体液体，将大大提高诊断的准确率。全唾液主要为多个腺体的分泌混合物，唾液的分泌受多种因素影响，例如时间、季节、个体状态及体位等。Shannon^[26]认为采取坐直，眼睛睁开同时头稍微前倾是最佳的留取唾液的方式。

最常用的刺激方式有咀嚼医用石蜡、橡皮筋、口香糖及柠檬酸等通过味觉和咀嚼的方式使唾液的流量增加^[27]。Michael等^[16]用2％柠檬酸刺激舌的后侧，分别收集腮腺、舌下腺和颌下腺单一腺体来源的液体，经过超速离心后获得高纯度的外泌体。然而全唾液无论是刺激还是非刺激形式，经过超速离心法分离后都会出现黏稠物，有拉丝现象。显然目前学者都避开了这一点，虽然尚无文献证明这对外泌体的分离和重悬有影响，但优化实验方法或者对唾液正确的预处理无疑将大大提高分离外泌体的效率。在尿液中，如果降低其pH值可以提高外泌体的分离效率。目前唾液留取尚无统一标准，但多数学者建议唾液的收集宜在上午10:00至12:00进行，同时应禁食、禁饮水至少1 h，清洗口腔后静坐5 min留取唾液，收集于无菌管中。

三、唾液外泌体与疾病的联系

唾液外泌体含有蛋白质、mRNA、miRNA等信号分子，它们反映分泌细胞的生理状态及其功能状态，还包含细胞病理相关的分子信息，为疾病诊断提供了丰富的潜在生物标志物来源。唾液外泌体不仅与口腔相关疾病有关，还与其他系统疾病有密切关系。

1．唾液外泌体与口腔疾病：

唾液中富含黏蛋白、各种酶类以及一些免疫球蛋白，构成了口腔的第一道防线。口腔慢性疾病很大一部分原因是由于口腔免疫的异常。唾液外泌体蛋白质组学研究发现，外泌体中富含IgA和qIgR，发挥着抗炎作用^[14]。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma ，OSCC ）发病率呈逐年上升及年轻化趋势，严重威胁患者生命^[28]。OSCC自身分泌的外泌体或通过低氧诱导因子1ɑ （hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1ɑ）和HIF-2ɑ依赖途径，促进肿瘤细胞的迁移和浸润，进一步研究发现外泌体中的miR-21在肿瘤转移中发挥重要作用^[29]。口腔肿瘤易转移，病理活检不仅对患者损伤大且往往只有在病变晚期才能确诊，这就迫切需要新的手段检测口腔肿瘤。对口腔肿瘤患者和健康人群唾液外泌体对比发现，两者的外泌体在形态学和分子标志方面都发生了明显改变，这为发现高危患者的恶性变化提供了早期诊断手段^[30]。外泌体也参与某些口腔慢性炎症的发病和进展，如口腔扁平苔藓（oral lichen planus ，OLP ）发病机制不明且诊断往往滞后，在筛查OLP和健康人群时发现，二者唾液外泌体中的miR-4484、miR-1246及miR-1290表达差异有统计学意义，提示外泌体源性的miRNA可以作为潜在的OLP生物标志物，也为进一步研究OLP的致病机制提供了理论基础^[31]。干燥综合征（Sjögren's syndrome，SS）是一种侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺体，以淋巴细胞高度浸润为特征的弥漫性结缔组织自身免疫性疾病。Hu等^[23]对原发性干燥综合征（primary Sjögren's syndrome，pSS）患者唾液中蛋白质和mRNA表达谱进行分析，观察到有16种蛋白质水平、27种mRNA表达和对照组有显著差异，这些信号分子一旦被证实将提高pSS的早期诊断准确率。Alevizos等^[32]分析了SS与健康人小唾液腺中miRNA的表达谱，发现hsa-miR-768-3p明显上调，hsa-miR-574下调，虽然并未阐明其具体的致病机制，但miRNA可以作为早期诊断SS的标志物。虽然目前尚无关于SS的外泌体中miRNA的相关报道，但目前文献分析表明，miRNA是"打包"入外泌体膜内，对SS患者唾液外泌体中miRNA表达谱进行分析，若发现某些miRNA特异性表达增高，将对SS患者早期诊断，及时治疗提供科学依据。

2．唾液外泌体与其他系统疾病：

随着唾液组学研究的不断深入，将唾液作为研究疾病的手段已不仅仅局限于口腔相关疾病，还扩展到其他系统性疾病，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤性疾病^{[33,34,35,36]}，还有一些慢性自身免疫性疾病如SS、类风湿关节炎及糖尿病等^[23]。

近年来，我国乳腺癌的发病率持续增长，早期乳腺癌症状和体征往往不典型，早期发现将极大改善疾病预后。对乳腺癌患者和健康对照组比较后发现，唾液中8种mRNA和碳酸酐酶6 （carbonic anhydraseⅥ，CA6）可成为非侵入性诊断的生物标志物，用于乳腺癌的早期诊断^[34]。但尚不清楚远端的系统疾病诱导口腔唾液组分变化的机制。近年来Lau和Wong^[35]研究发现，乳腺癌源性外泌体可激活口腔唾液腺细胞的转录机制，从而改变唾液源性外泌体的RNA和蛋白组成。Lau等^[36]通过构建小鼠胰腺癌模型，证明肿瘤来源的外泌体存在对胰腺癌患者唾液转录组表达有调控作用。唾液作为口腔以外疾病的辅助诊断的一大优势就是无创性，由唾液获得系统疾病的信息将极大促进疾病的诊断和治疗。唾液外泌体还可以作为衰老的分子标志，研究表明唾液外泌体中的miR-24-3P可作为衰老的一种新的生物标志，但还需进一步在人群中验证^[37]。一直以来，研究者都集中在疾病组和健康组的比较观察外泌体中蛋白质组和miRNA的差异，若发现某组分特异性升高，也只能证明这两组人群的差异，无法证明是这一疾病的特异性标志物，还需在不同的疾病组之间进一步比较，提高其作为标志物的特异性，然而这却是研究者最常忽略的。

3．唾液外泌体作为治疗载体：

外泌体参与细胞间的信号转导，可以在细胞间传递蛋白质及遗传物质等，利用此性质，如将药物包裹于外泌体中依据其表面分子标志与特定组织和细胞结合从而可以达到靶向治疗的目的^[38,39]。姜黄素有抗炎、抗氧化、抗恶性细胞增生和抗血管生成的作用，运用脂质体作为载体成功解决了其在血液中的溶解度和稳定性的问题^[40]。Sun等^[41]将外泌体作为载体包裹姜黄素后可以增强药物在血液中的稳定性和浓度，并且外泌体来源于宿主，不会诱发排斥等免疫反应，提供了一种新型的药物载体。利用外泌体包裹的药物通过鼻内给药的方式治疗脑部疾病，其机制为外泌体可以通过血脑屏障到达中枢神经系统发挥效应，治疗脑部炎症^[42]。

四、其他腺体外泌体与疾病的联系

肝脏作为体内最大的外分泌腺体，不论是肝细胞还是胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞，均能释放外泌体^[43]。肝细胞来源的外泌体内有鞘磷脂的合成机制，在CXCR-1依赖的途径下肝细胞可产生更多的外泌体，其胞内的中性鞘磷脂酶和神经酰胺促进细胞的增殖，可调节肝细胞缺血/再灌注损伤后恢复和再生^[44]。外泌体是一种重要的分子实体，在肝内进行细胞-细胞间联络，与肝脏的生理学和病理生理学都密切相关。前列腺癌患者血清中外泌体上表皮生长因子受体高表达，这也在细胞系中得到了验证^[45]。这一现象说明前列腺组织或细胞来源的外泌体对细胞的增殖、调控有重要作用。

随着研究的不断深入，唾液外泌体逐渐成为一种实用和可靠的认识疾病、了解疾病，甚至治疗疾病的手段。留取唾液标本避免了患者的痛苦及感染风险，且方便、安全、无创。外泌体作为一种新型的生物标志物，其辅助诊断价值显而易见，但由于分离方法、成本等问题还未应用于临床。虽然分离方法学已经建立，但如何更好地分离全唾液中的外泌体仍在探索中。目前许多疾病分子机制并不明确，或许对外泌体的分子信号的研究能有助于解决此难题。外泌体是一种天然的载体，免疫原性低，将药物包裹及靶向治疗特别是对治疗神经系统性疾病有着极大优势，也将会是未来研究的重点。