目前，金属三维打印技术可制作复杂的金属结构，并可较精确地控制尺寸，在口腔医学领域应用的前景广阔[1,2]，而最具应用前景的两种金属三维打印技术为电子束选区熔化（electron beam melting，EBM）和激光选区熔化（select laser melting，SLM ）[2,3]。生物材料制备的修复体表面性能对其生物相容性有重要影响，可直接影响细胞的黏附与增殖能力[4]；已有研究显示，三维打印制作的钛合金（Ti-6Al-4V）修复体适于细胞黏附和增殖[5,6]，但关于三维打印钛材料的表面性能鲜见报道。本项研究以锻造钛合金为对照，对比EBM和SLM制作的钛合金试件的表面性能，同时观察骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell ，BMSC）在试件表面的黏附和增殖情况及细胞超微结构，以期为三维打印钛合金的临床应用提供依据。
EBM钛合金试件（Arcam A1, Sweden）由北京爱康宜诚医疗器材股份有限公司提供（金属粉末为Arcam, Sweden）。SLM钛合金试件（EOS M280，Germany）由西安铂力特激光成形技术有限公司提供（金属粉末为TSI，British）。选择3种规格的钛合金试件：10 mm×10 mm× 2 mm用于细胞黏附和增殖计数、表面形态扫描电镜观察、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）及电感耦合等离子体-质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）分析。5 mm×5 mm×2 mm用于细胞黏附和增殖的扫描电镜观察。20 mm×20 mm×2 mm用于表面接触角、粗糙度及透射电镜检测。试件打印方向均为水平方向（粗糙度检测试件打印方向为水平和垂直方向）。用于细胞实验的试件用砂纸抛光至600目后超声波清洗、备用[7]。
选SLM和EBM试件各1个，按ISO 15989:2004标准，用乙醇清洗后置于接触角测定仪（OCA-20，Germany）上，用微量注射器缓慢将去离子水滴于试件上，使光源中心、试件表面、液滴、目镜在一个水平面上，测量左右两个接触角，同一试件再选两个点重复操作，结果取均值。
选SLM和EBM试件各1个，应用场发射扫描电镜（JSM-7001F，JEOL，日本）观察。
按照GB/T 1031-2009标准，用粗糙度仪分别测试SLM和EBM水平方向打印的试件（每组各1个）和垂直方向打印的试件（每组各1个）的粗糙度。同一试件共测量3次，结果取均值。
将试样抛光至2 000目，氩离子轰击时间延长至10 min。设置条件：Al Kα激发源，靶电压和靶电流分别为15 kV和10 mA，真空室气压小于2×10-6 Pa，分析器传输能量为200 eV，测量步长为0.1 eV，溅射速度为0.2 nm/s，溅射面积为2 mm× 2 mm。用XPS PEAK4.1软件分析结果，所需XPS标准谱线数据引自XPS手册。
选取1岁龄雌性比格犬，30 g/L戊巴比妥钠按30 mg/kg静脉麻醉，无菌条件下抽取骨髓10 ml接种后培养，细胞接近融合时消化和收集细胞悬液，按1∶2接种传代。
第5代BMSC接种至6孔板（5×105个/孔）与试件共培养（选择锻造、SLM和EBM试件各3个），3 d后收集培养液，用ICP-MS (7700 series ICP-MS，America）检测Ti、Al、V质量浓度。
选锻造、SLM和EBM试件，接种第5代BMSC，分别于0.5、2、4、20 h和3、7 d（每组每个时间点试件各3个），取出试件用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗3次，用3％戊二醛固定24 h，乙醇梯度脱水，每次5 min。临界点干燥仪干燥（K850，Quorum，UK），镀膜仪喷金（EM SCD 500, Leica, Germany），扫描电镜观察（TM3000，HITACHI ，Japan）。
第5代BMSC接种于3组试件上（每组样本量为5），37 ℃、5%CO2培养箱中培养。3 d后取出，PBS冲洗3次，试件置于含2％硝酸镧的3％戊二醛溶液中固定2 h，刮下细胞。对细胞团进行梯度脱水，每次10 min。包埋、固化后，切成50~70 nm切片，染色后透射电镜观察。
选锻造、SLM和EBM试件，接种第5代BMSC (5×105个／试件），分别于培养0.5、2、4、20 h和3、7 d后取出（每个时间点每种试件各3个），PBS清洗3次，胰蛋白酶消化30 s，吹打形成单细胞悬液，注入细胞计数板，应用细胞计数仪（Countstar IC1000，上海睿钰生物科技有限公司）检测。
采用SPSS 19.0统计软件，对3组结果进行单因素方差分析，组间比较使用独立样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。
EBM和SLM试件表面接触角分别为86.83° ± 0.21°和101.80°±0.27°，即EBM试件的亲水性优于SLM试件；两者接触角均>65°，均为疏水性材料。
见图1。EBM和SLM试件均为不规则不连续的粗糙表面；相比SLM组，EBM组试件表面稍光滑，表面颗粒在2~ 6 μm之间，可见一些3~4 μm的微孔。
见表1。水平方向上SLM组粗糙度与EBM组差异无统计学意义（P>0.05）。垂直方向上SLM组表面粗糙度显著小于EBM组（P<0.01）。
 | 表1 两组三维打印钛合金试件不同方向表面粗糙度的比较（μm） |
两组三维打印钛合金试件不同方向表面粗糙度的比较（μm）
| 组别 | 水平方向 | 垂直方向 | ||
|---|---|---|---|---|
| 测量次数 |  ± s | 测量次数 |  ± s | |
| EBM组 | 3 | 3.20±0.08 | 3 | 19.96±0.89 |
| SLM组 | 3 | 3.31±0.15 | 3 | 12.65±0.55 |
| t值 | 2.096 | 8.631 | ||
| P值 | 0.104 | 0.001 | ||
注：EBM为电子束选区熔化；SLM为激光选区熔化
在延长氩离子轰击试件表面时间的情况下，3组试样表面均检测出C、O、Ti、V、Al、N元素。结合XPS数据手册可知，3组试件表面均含TiO、Al2O3、V。这些均是Ti-6Al-4V表面氧化膜的成分。
见表2。结果显示，SLM组细胞培养液Ti、Al、V离子质量浓度最低，锻造组与EBM组相近。3组析出Ti、Al、V质量浓度均为微克级。
 | 表2 各组钛合金试件细胞培养液析出Ti、Al、V质量浓度的比较（μg/L， |
各组钛合金试件细胞培养液析出Ti、Al、V质量浓度的比较（μg/L，
± s）
| 组别 | 样本量 | Ti | Al | V |
|---|---|---|---|---|
| 锻造组 | 3 | 109.4±0.28 | 29.04±0.19 | 11.74±0.19 |
| SLM组 | 3 | 109.0±0.40 | 23.92±0.12a | 11.16±0.11 |
| EBM组 | 3 | 110.4±0.40 | 32.46±0.33ab | 12.30±0.21b |
| F值 | 4.633 | 348.900 | 10.730 | |
| P值 | 0.061 | 0.000 | 0.010 |
注：EBM为电子束选区熔化；SLM为激光选区熔化；a表示与锻造组相比P<0.05；b表示与SLM组相比P<0.05
见图2。细胞在3种试件上的形态变化、黏附和增殖并无明显差别。细胞数量在黏附和增殖阶段均明显增加。细胞在黏附阶段形态变化明显，由球形变为长梭形（4 h至3 d尤其明显），细胞突起交织成网状，第7天细胞形态变为星形，与2 h时形态相似，高倍镜下观察可见细胞伪足，微绒毛及细胞基质。相比而言，微绒毛在第3天最长最多，第7天分泌的细胞基质最多，表明细胞的生存状态良好。
见图3。透射电镜观察黏附于3组试件上的BMSC无明显差别，均未见细胞器的超微结构有损伤。细胞间无明显的连接结构。胞质中有丰富的高尔基体、线粒体和少量的基质小泡，呈同心圆状的髓样体和空泡结构。少量硝酸镧颗粒在细胞膜周围，细胞内未见硝酸镧颗粒。
见图4。同一时间点3组细胞黏附量接近，差异均无统计学意义（P> 0.05 ），随着培养时间延长，细胞数量增加明显。在细胞黏附阶段，同组0.5 h与2 h、4 h与20 h细胞黏附量差异均无统计学意义（P >0.05）。从0.5 h到20 h，EBM和锻造组细胞黏附量增加了约33%（P<0.05），而SLM组增加了约25%（P >0.05）。培养3 d到7 d的细胞增殖阶段，每组细胞数急剧增加，增加了约150%（P<0.01）。
EBM：电子束选区熔化；SLM：激光选区熔化；a：与同组培养0.5 h、2 h相比P <0.05；b：与同组培养3 d相比P <0.05
细胞的黏附能力与材料的亲疏水性密切相关，本项研究表面接触角结果显示，SLM组接触角大于EBM组，可能是由于SLM试件表面的粗糙度稍高于EBM试件。两种三维打印试件均属于疏水性材料[8]，不是适合细胞黏附的最佳表面状态。因此，今后应对SLM和EBM植入体进行表面改性，提高亲水性，以利于细胞黏附。已有研究显示，虽然细胞易黏附于亲水性材料，但不同种类细胞有不同的最适接触角[9]。找出最适合BMSC黏附的角度，对骨修复材料的表面改性有重要意义，这尚待深入研究。
生物材料的表面形态对细胞黏附、增殖有重要作用。非光滑表面较光滑表面更有利于细胞黏附[10,11]。已有研究显示，粗糙表面的颗粒直径在63~90 μm最适合细胞黏附和增殖，而颗粒直径大于300 μm并不能提高细胞黏附率[12]。本项研究扫描电镜图片显示，SLM和EBM钛合金试件表面的颗粒均小于这个范围。因此，可用提高试件表面粗糙度作为表面改性的方法。Ponader等[13]认为，材料表面粗糙度大于56.9 μm不利于细胞增殖。因此，材料表面粗糙度不可无限增加。本项研究亲水性实验显示，SLM和EBM钛合金试件均为疏水性材料；扫描电镜可见SLM和EBM钛合金均属于不规则不连续的粗糙表面形态，相比连续规则的微纹理表面，并不利于细胞黏附和增殖[14,15]，因此SLM和EBM制备的钛合金表面并不是利于细胞黏附、增殖的最佳表面形态。
钛或钛合金氧化膜具有降低排异反应，促进骨整合的作用[16,17]。本项研究XPS结果提示，SLM与EBM试件均可产生氧化膜，另外，为了更好地证实SLM和EBM能产生氧化膜，本项研究XPS检测时延长了氩离子的轰击时间，结果显示试件表面均含TiO、Al2O3、V，说明SLM与EBM表面可形成氧化膜。检测出的钛氧化物为TiO而非TiO2，可能是由于氩离子轰击试件表面时间过长，接近基底层，导致测量部位为氧化膜深层[18]。
耐腐蚀性差的金属材料植入体内后，析出的有害离子成分可对机体造成伤害[19,20]。已有研究显示，高浓度Al、V离子可限制细胞DNA合成[21]；而低浓度Al、V离子析出量，不足以对细胞造成影响，反而有促进细胞DNA合成的作用[19]。细胞培养液金属离子析出质量浓度检测结果显示，EBM和SLM组Al、V离子质量浓度非常低，仅为微克级，说明EBM和SLM钛合金并不对细胞生长造成影响[19]。另外，SLM与EBM组试件上的微小孔洞可能对其耐腐蚀性能造成影响，这需深入研究。
为了了解表面性能对细胞的影响，本项研究从形态学角度观察，0.5 h到7 d BMSC形态变化及黏附、增殖数量均符合已有的对BMSC黏附、增殖过程的描述[21]，且细胞超微结构并未受损，说明细胞生存状态良好。细胞计数结果显示，相同时间点3组BMSC黏附量接近，说明3种试件表面性能及耐腐蚀性能相近；同时也说明虽然SLM与EBM组试件接触角不同，但两组细胞黏附量差异不显著。另外，随培养时间增加，同组不同时间点BMSC数量增加明显，也进一步说明了SLM与EBM组钛合金有较好的生物相容性。
本项研究显示，SLM与EBM两种工艺制备的钛合金植入物有良好的生物相容性，但其表面性能需进一步改进，如改变表面形态增加表面粗糙度，对表面进行化学修饰等[22]，以提高细胞黏附性，利于体内修复。
探讨电子束选区熔化（electron beam melting，EBM）和激光选区熔化（select laser melting，SLM）三维打印工艺对钛合金表面性能及细胞的影响，为三维打印钛合金的临床应用提供依据。
应用EBM和SLM制备钛合金（Ti-6Al-4V）试件，以锻造钛合金试件作为对照组。检测3组试件表面成分及EBM和SLM试件表面接触角、粗糙度及表面形貌。同时观察3组试件上骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的黏附、增殖和细胞超微结构，并比较细胞培养液离子析出情况。
EBM和SLM试件表面接触角均>65°，均为疏水性材料；两组试件表面粗糙度、表面形态相似，均可形成钛氧化膜，但不是利于细胞黏附的最佳表面结构。3组析出Ti、Al、V离子的含量均为微克级，不足以对细胞黏附和增殖造成影响。BMSC在3组试件上的黏附和增殖能力相近，随着培养时间延长，细胞数量增加明显；未见黏附于3组试件上的BMSC细胞器超微结构有损伤。
EBM与SLM工艺制备的钛合金具有良好的表面性能及细胞相容性。