骨骼干细胞鉴定与谱系分化的研究进展

骨骼系统是机体重要的运动系统，不仅支持躯体，保护器官，还能维持矿物质平衡，造血和内分泌功能。骨稳态的维持依赖骨形成和骨吸收的平衡，打破平衡将导致骨骼系统疾病，例如骨质疏松、骨硬化症、骨关节炎、佩吉特病等^{［1, 2, 3］}。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）作为成骨细胞的祖细胞，在骨骼疾病的临床治疗中具有重要价值。国际细胞治疗协会在指南中提出3个体外筛选MSC的标准：①细胞在体外培养下可贴壁生长；②细胞表达表面标志物CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、CD14/CD11b、CD79a/CD19及人类白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）；③细胞在体外可多向分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞^［4］。此标准可帮助研究者快速鉴定出MSC，但此标准均基于体外环境，难以真实反映干细胞在体内微环境中的细胞学特征。例如，黏病毒抵抗蛋白1 （myxovirus resistance protein-1， Mx1）阳性细胞满足以上标准，但在体内仅可分化为成骨细胞，不具有成脂和成软骨分化的潜能^［5］。此外，基于MSC的治疗策略存在有效性较低和效果不显著的问题，寻找异质性较低、表面标志物可靠且生物学特性明确的干细胞群对临床治疗和损伤修复至关重要。

随着干细胞谱系追踪、流式细胞术（flow cytometry，FCM）和单细胞测序技术的发展，骨骼干细胞（skeletal stem cell，SSC）的概念开始出现^［6］。SSC具有以下特征：①干细胞分布于骨骼相关的间充质中，包括骨、软骨、脂肪及骨髓基质；②干细胞谱系分化方向明确；③体内外均可自我更新和克隆形成；④体内外均能多向分化；⑤在连续体内移植实验中可保持异位成骨能力^［6］。因此，SSC是一群较MSC异质性更低、表面标志物更明确和克隆形成能力更强的干细胞。

SSC的分布存在时间和空间上的差异，其功能也由此各有不同。甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）阳性SSC在小鼠出生3 d后的生长板区开始出现，而瘦素受体（leptin receptor，LepR）阳性SSC则在8周龄成年小鼠骨髓腔开始出现^［7］。血窦周的SSC在维持造血中至关重要，而骨膜和颅缝的SSC则主要参与膜内成骨过程^{［8, 9］}。因而，阐明SSC在时间和空间上分布的差异，有助于干细胞治疗和干细胞修复应用中选择合适的干细胞类型和诱导因素。本综述将根据各类型SSC在空间分布的异同，分别讨论干细胞特性和谱系分化。

一、颅缝的SSC

颅颌面骨的发育方式主要是膜内成骨。在此过程中，颅缝、牙槽骨和牙等部位的祖细胞不分化为软骨细胞而直接分化为成骨细胞^{［10, 11］}。研究显示在颅缝、牙周膜和牙髓等处存在干细胞微环境。

1. 神经胶质瘤相关癌基因1（glioma-associated oncogene 1，Gli1）阳性SSC：Gli1是Hedgehog信号通路的重要转录因子，与骨发育和骨稳态密切相关^［12］。研究发现颅缝存在Gli1⁺SSC，具有自我更新，克隆形成和多向分化的能力^［9］。Gli1⁺细胞受印度刺猬因子（Indian hedgehog，IHH）信号通路调控，抑制IHH可导致骨量减少。Gli1⁺细胞对颅缝干细胞微环境的维持至关重要，当用白喉毒素选择性消融Gli1⁺细胞后，小鼠表现出颅缝早闭、生长迟缓、骨质疏松等表型。此外，牙周膜内也存在Gli1⁺细胞，可分化为牙骨质细胞和骨细胞^［13］。

2. Axin2⁺SSC：Axin2是Wnt/β-联蛋白信号通路的抑制因子，可抑制膜内成骨过程，Axin2失活可导致颅缝早闭^［14］。Maruyama等^［15］发现Axin2可标记一群颅缝干细胞。Axin2⁺干细胞主要在颅缝表达，在长骨不表达。Axin2⁺颅缝干细胞可自我更新和克隆形成，在发育和稳态维持中能不断分化为成骨细胞。Axin2⁺颅缝干细胞可在肾被膜下异位成骨，结构和颅骨类似，几乎不形成骨髓腔。受到损伤刺激时，Axin2⁺颅缝干细胞可迅速增殖并直接分化为成骨细胞和骨细胞。此外，Axin2⁺与Gli1⁺颅缝干细胞的分布存在部分重叠，但Gli1⁺干细胞在颅缝广泛分布，Axin2⁺颅缝干细胞则主要聚集于颅中缝^［9］。另外，Axin2⁺干细胞也分布于牙周膜内，参与拔牙后骨损伤修复^［16］。

3. 配对相关同源盒基因1 （pair-related homeobox gene，Prx1）阳性SSC：Prx1是一种在胚胎发育时期广泛表达于四肢肢芽和颅面骨的转录因子，是骨骼发育研究的重要标志物^［17］。Wilk等^［18］发现Prx1可标记一群出生后表达在颅缝的SSC。Prx1⁺SSC不调控颅骨发育，约出生后2周时特异性表达于后额缝、冠状缝、矢状缝和人字缝，并且随年龄增长而逐渐减少（8~32周）。Prx1⁺SSC可自我更新分化为成骨细胞，并有异位成骨能力。白喉毒素选择性消融Prx1⁺细胞可抑制颅骨缺损的修复^［18］。此外，基因Ctsk和Mx1⁺αSMA⁺也可标记颅缝的骨膜干细胞^{［8， 19］}。

二、长骨骨髓腔SSC

长骨骨髓腔存在大量造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）和SSC赖以生存的微环境^［20］。髓腔SSC不仅参与骨发生，而且维持HSC稳态^［21］。大量髓腔SSC标志物被鉴定出来，包括Prx1、Nestin、LepR、Mx1、血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、 CD51、CD146及趋化因子CXC亚家族12配体（chemokine CXC subfamily ligand 12，CXCL12）等^{［5， 7， 21, 22, 23］}。这些细胞除表现出SSC的自我更新，克隆形成与多向分化能力外，还常表达造血稳态相关基因，如CXCL12、血管生成素1、白细胞介素7等^［21］。

1. 小鼠SSC：2014年，斯坦福大学Michael Longaker团队首次鉴定出小鼠 SSC并绘制了细胞分化图谱^［24］，他们消化并收集股骨细胞，通过FCM分选出一群CD45^-Ter-119^-Tie2^-AlphaV⁺细胞。并进一步基于表面标志物CD105、Thy、 6C3和CD200表达的差异，将细胞分为8个亚群。体外诱导分化和体内肾被膜下移植实验证明，CD45^-Ter-119^-Tie2^-AlphaV⁺Thy^-6C3^-CD105^-CD200⁺（缩写为AlphaV⁺Thy^-6C3^-CD105^-CD200⁺）细胞位于小鼠SSC谱系分化顶端，具有自我更新和克隆形成能力，是其余7个亚群的亲代细胞。AlphaV⁺Thy^-6C3^-CD105^-CD200⁺SSC与子代细胞存在广泛的旁分泌调控。此外，AlphaV⁺Thy^-6C3^-CD105^-CD200⁺SSC及其子代细胞的命运是可逆的。血管内皮生长因子抑制剂能诱导SSC软骨向分化，与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2联合应用则可诱导脂肪组织成软骨。

2. 人SSC：2018年，Longaker团队鉴定出了人SSC（PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺hSSC）^［25］。PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺SSC可以从胎儿和成人骨骼，BMP2处理的脂肪组织以及诱导多功能干细胞中分选出。与小鼠SSC类似，人PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺SSC同样具有自我更新和克隆形成能力；在肾移植实验中表现出持续的异位成骨能力；骨缺损时可迅速增殖分化。然而，骨骼发育相关基因如WNT、BMP、Hedgehog、成纤维细胞生长因子及Notch在人SSC和鼠的SSC的表达存在一定差异，基因SOST、SCCX4、DNAJB6等只在小鼠SSC表达。此外，研究还显示人SSC与HSC通过细胞因子互作，共同维持骨髓微环境^［25］。

3. LepR⁺SSC：LepR是成年小鼠SSC标志物^［7］。LepR⁺SSC主要分布于静脉窦和动脉窦周围，与其他干细胞标志物如PDGFα、CD51、PDGFβ、CD105及Prx1等有很大程度的重叠。LepR⁺细胞只占髓腔细胞总数的0.3%，但是却构成了94%±4%的克隆形成单位。LepR⁺细胞从2个月龄小鼠髓腔开始出现，在生理状态下不断分化形成骨和脂肪，在病理情况下可以分化为软骨。虽然LepR⁺细胞多处于静止状态，但在骨折或辐射的刺激下可迅速增殖，参与损伤修复过程。此外，在辐射损伤后的骨髓腔，LepR⁺细胞能分化为脂肪细胞，并且通过分泌干细胞因子和CXCL12，维持HSC的增殖与再生^［26］。

4. CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24⁺SSC：CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24⁺SSC位于骨髓腔窦周，具有较强的克隆形成能力^［27］。同时它可分化为CD45^-CD31^-Sca1^-PDGFα⁺软骨-骨前体细胞（osteochondrogenic progenitor cell，OPC）和两类脂肪前体细胞：CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24^-脂肪前体细胞（adipogenic progenitor cell，APC）和CD45^-CD31^-Sca1^-Zfp423⁺前脂肪细胞（pre-adipocytes，preAd）。在骨缺损修复中，CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24⁺SSC和OPC能促进修复，但APC和preAd却通过分泌二肽基肽酶-4延缓愈合过程。此外，高脂饮食和老龄化可促进CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24⁺细胞向APC的分化。在辐射导致的造血功能障碍小鼠中，移植 CD45^-CD31^-Sca1⁺CD24⁺SSC能够促进HSC的再生，但移植APC和preAd却抑制造血系统的修复。

5. Gli1⁺SSC：位于生长板下软骨-骨松质交界处的Gli1⁺细胞也表现出SSC的性质^［28］。Gli1⁺细胞表达干细胞表面标志物，且能在骨髓腔内分化为成骨细胞、骨髓基质细胞和脂肪细胞。Gli1⁺SSC对小鼠骨骼发育至关重要，1个月龄小鼠骨髓腔中约50%和80%的Gli1⁺细胞分别为Osterix和Col1a1阳性。白喉毒素选择性消融Gli1⁺细胞可导致骨量降低。然而，Gli1⁺SSC主要参与到小鼠骨骼生长发育过程（约至出生后4个月），它在成年小鼠骨稳态中的作用逐渐被LepR⁺细胞替代^［7］。

6. Gremlin1⁺SSC：Gremlin1⁺SSC位于生长板下，只占骨髓细胞的0.002 5%。相比早期鉴定出的Nestin1⁺细胞，Gremlin1⁺细胞具有更强的克隆形成能力，在体内能够分化为骨，软骨和网状基质细胞。然而，Gremlin1⁺SSC不能分化出脂肪组织，因此也被称作骨-软骨-网状细胞^［29］。

7. 其他窦周SSC：同源盒基因11（Homeobox 11，Hox11）阳性细胞也是一类SSC，特异性表达在成体小鼠桡尺骨和胫腓骨的骨膜和骨髓腔血管周围。Hox11⁺细胞高表达PDGFRa、CD45和LepR等干细胞标志物，具有克隆形成能力，体内外均能三向分化并参与骨折的修复^{［30, 31］}。最近，有研究也发现在骨损伤情况下，窦周静止的CXCL12⁺骨髓基质细胞能够通过经典Wnt通路而活化为CXCL12⁺SSC，上调成骨能力以参与修复过程^［32］。

三、生长板区的SSC

生长板是随着级次骨化中心形成而出现于长骨骺端的一层透明软骨结构，介导软骨内成骨过程。根据生长板内软骨细胞分化时期的不同，可将其分为静止层、增殖层、肥大前层和肥大层^［33］。近年来研究发现，生长板静止层存在干细胞龛和SSC^［34］。

1. PTHrP⁺SSC：2018年，Noriaki Ono团队鉴定出一群在生长板静止层并且表达PTHrP表面标志物的SSC^［35］。通过构建PTHrP-mCherry鼠进行谱系追踪，他们发现PTHrP⁺SSC在小鼠出生后3 d（P3）开始出现，P6~P9快速增殖，P15达到峰值。随着生长发育，静止层的PTHrP⁺SSC逐渐分化为增殖细胞和肥大细胞，最终进入骨髓腔。一部分PTHrP⁺细胞可转分化为Col1a1-GFP⁺成骨细胞与CXCL12-GFP⁺骨髓基质细胞，但是不能分化为脂肪细胞。在生长板损伤等病理状态下，PTHrP⁺细胞则可直接分化为成骨细胞。PTHrP⁺细胞的部分丧失可以导致增殖层软骨细胞病理性肥大。在体外，PTHrP⁺细胞可自我更新、克隆形成和多向分化。FCM结果显示PTHrP⁺SSC与AlphaV⁺Thy^-6C3^-CD105^-CD200⁺SSC存在部分重叠。

2. Col2⁺SSC：Andrei Chagin团队通过构建Col2-creERT（R26R-Confetti）小鼠示踪Col2⁺软骨细胞和子代克隆，阐明了胚胎和成体小鼠软骨内成骨异同；结果发现在次级骨化中心形成前（胚胎期及出生早期），软骨内成骨是通过消耗骺端软骨前体细胞进行的，这些细胞只有形成有限克隆的能力；次级骨化中心形成后，生长板静止层干细胞龛随之出现，维持了细胞的干性。因而，这时的生长板静止层干细胞存在一群Col2⁺SSC^［34］。

四、骨膜的SSC

骨膜位于骨骼表面，富含成骨前体细胞，在膜内成骨过程中至关重要。研究证明骨膜内存在一群SSC，相比于骨髓MSC具有更强的克隆形成与增殖能力，且受骨膜蛋白的调控^［36］。同时已有研究成功地在骨膜中鉴定出Ctsk⁺SSC和SMAa⁺Sca1⁺SSC^{［8， 19］}。

1. Ctsk⁺SSC：组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）是一种主要由破骨细胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，介导骨吸收和骨改建过程，因此一直以来被视作破骨细胞的特异性标志物^［37］。直到2013年，Yang等^［38］意外发现在骺板软骨膜兰氏结存在一群Ctsk⁺细胞，在敲除蛋白酪氨酸磷酸酶基因后导致内生软骨瘤和骨软骨瘤的发生，提示这群细胞为间充质来源。Dabnath等^［8］阐明了Ctsk⁺细胞是骨膜干细胞，分布于长骨骨膜和颅缝，并利用Ctsk-mGFP小鼠谱系追踪和单细胞测序技术鉴定出Ctsk⁺骨膜干细胞和其两个亚群骨膜祖细胞。Ctsk⁺干细胞可在连续的肾被膜下和乳腺脂肪垫移植实验中维持自我更新、克隆形成及多向分化能力。条件性敲除Ctsk⁺细胞成骨关键基因Osterix会导致骨皮质结构异常。有趣的是，在骨损伤状态下，Ctsk⁺细胞可以介导骨膜的软骨内成骨过程参与骨修复，而非局限于膜内成骨。人骨膜干细胞也可被CTSK蛋白标记，且生物学特性和小鼠骨膜干细胞类似。邹卫国团队也证明Ctsk可标记骨膜前体细胞^［39］。利用Ctsk-Cre条件性敲除肝激酶B，可促进Ctsk⁺细胞异常增生和成骨分化，导致原发性骨肉瘤的发生^［39］。

2. aSMA⁺Sca1⁺SSC：在成体骨膜中，αSMA和Mx1也标记了一群骨膜干细胞^［19］。aSMA⁺Sca1⁺SSC高表达干细胞标志物，具有克隆形成和多向分化能力。同时，aSMA⁺Sca1⁺细胞长期稳定存在，不断分化为骨膜成骨细胞参与骨稳态维持。更重要的是，aSMA⁺Sca1⁺细胞表达CXC趋化因子配体-5 、趋化因子受体3辅助受体和趋化因子受体5辅助受体，在骨缺损修复过程能够迁移到受损部位。此外，该研究表明LepR也在aSMA⁺Sca1⁺细胞高表达，提示LepR也是骨膜干细胞的标志物之一。

五、单细胞测序技术绘制SSC分化图谱

在利用谱系追踪和FCM鉴定SSC的同时，单细胞测序技术结合了高通量组学和单细胞异质性的特点^{［40, 41］}，清晰地绘制出SSC谱系图。在骨发生阶段，Kelly等^［42］对小鼠胚胎E11.5、E13.5、E15.5和E18.5的下肢肢芽进行单细胞测序，阐明了在不同发育阶段各组分（软骨、骨、肌肉及血液等）的占比和发育中相关标志物的表达变化。而 Zhong等^［43］比较了小鼠年轻（1个月龄）、成年（3个月龄）和衰老（16个月龄）骨髓间充质细胞亚群，同时在年轻小鼠中发现了一群静止的、不含脂滴，但表达成熟脂肪相关标志物的脂肪前体细胞。Wolock等^［44］对8~16周龄的小鼠骨髓中非造血系来源的基质细胞进行了单细胞测序，将干细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分为了7个亚群，并由此绘制了谱系分化图，比较各个亚群和不同分化时期转录组的表达差异，为骨髓微环境的组成成分提供了重要的参考。

Tikhonova等^［45］构建Cdh5-Cre； LoxP-tdTomato、LepR-Cre； LoxP-tdTomato和Col2.3-Cre； LoxP-tdTomato荧光报告小鼠，对骨髓血管、干细胞和成骨细胞进行了单细胞测序，成功把CD45^lowTER119^lowtdTomato⁺细胞分为10个亚群，并描述在不同亚群之间，以及在生理和应激状态细胞转录组表达的异同。Baryawno等^［46］将骨髓基质分为了17个亚群，其中包括间充质细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞亚群等，并系统探究了LepR⁺、Nestin⁺、NG2⁺等SSC在调控HSC微环境中的功能异同，阐明了原发性白血病对骨髓基质细胞的重塑。

此外，Severe等^［47］还创新性地使用32种抗体标记骨髓基质细胞，并通过基于质谱流式细胞术的单细胞蛋白测序技术，分析了生理和辐射损伤状态下骨髓基质细胞的稳态维持和功能应激。Baccin等^［48］将单细胞测序技术和激光捕获显微切割技术相结合，发现骨髓富含CXCL12的网状细胞的成骨（CXCL12⁺Alpl⁺）和成脂（CXCL12⁺Alpl^-）两个亚群，分别分布于小动脉和静脉窦周围，分泌细胞因子维持血管周围微环境。

六、结语

本文综述了SSC和MSC的异同，并回顾了骨骼4个部位（颅缝、生长板、骨髓窦周和骨膜）的SSC鉴定和功能研究，对比了不同SSC在时空和功能上的差异，并探讨了运用单细胞测序技术绘制SSC谱系图。然而，不同SSC标志物存在不同程度的重叠，它们之间的关系仍待进一步探索。SSC与造血微环境的交互也仍待阐明。在代谢紊乱、炎症、肿瘤等病理状态下，SSC将如何响应以及SSC对内分泌、代谢的系统调控等，均需要进一步研究。

此外，颅面部SSC的种类和功能亟待阐明。目前研究仅在颅缝和牙周膜发现部分SSC标志物，长骨的众多标志物是否也能标记颅面骨仍待确认。此外在颌骨再生中，例如拔牙创愈合、牙周膜损伤修复、牙髓再生等，哪些干细胞参与此过程以及他们如何适应微环境的改变，都仍待进一步探索。此外，在牙周创伤和正畸牙移动情况下，SSC如何响应力的作用调控自身干性、增殖和成骨潜能，仍待继续研究。最近研究发现颌骨干细胞可塑性较高，在牵张成骨过程中可去分化回到神经嵴细胞的原始状态参与骨再生^［49］。

综上所述，随着生物技术的不断发展，SSC的鉴定和功能研究将进一步完善。同时，阐明SSC在细胞和分子层面的机制也有望为干细胞治疗提供更多可能。