再生性牙髓治疗的生物学基础及临床探索

再生性牙髓治疗（regenerative endodontic therapy）是一种生物学替代治疗手段，针对的是牙髓-牙本质复合体及牙根结构受到损伤、牙本质停止生长的患牙^［1］。治疗目标不仅是消除患牙的临床症状和体征，还需要能再生受损的牙髓-牙本质复合体，促进年轻恒牙的牙根发育^［2］。再生性牙髓治疗历经20多年的发展，文献中的名称多样，内涵各有异同。本文就牙髓血运重建、牙髓再血管化、牙髓再生以及再生性牙髓治疗等名称演变、治疗的生物学基础及临床探索进行回顾、分析和阐述，以引导再生性牙髓治疗相关研究和临床技术的合理发展。

一、治疗技术起源及文献趋势

早在20世纪60至70年代，Ostby^［3］、Nygaard- Ostby和Hjortdal^［4］对犬摘除牙髓的根管及牙髓坏死根管用刺激根尖孔向根管内引入血凝块的方法尝试牙髓治疗，随后以同样方法做了一组临床病例。这两个实验均进行了组织学观察，最初为活髓牙的根管内可见纤维结缔组织和细胞牙骨质；但在牙髓坏死的牙齿中，根管内未见修复组织形成。此后学者们大多关注年轻恒牙外伤脱臼再植后的牙髓血运重建情况，或研究根管消毒手段以获得根管感染患牙良好的感染控制效果。2001年Iwaya等^［5］首次报道对慢性根尖周炎的年轻恒牙进行再生性牙髓治疗，获得牙根继续发育、牙髓恢复活力的成功临床病例，标志着再生性牙髓治疗这一崭新的牙髓治疗方法诞生。自此，各种研究和临床报道逐渐出现。从2001至2020年检索出收录于PubMed的英文文献609篇，检索关键词为revascularization、revitalization及regenerative endodontics；于中国知网、万方数据库、维普数据库检索出中文文献245篇，关键词为对应于上述英文词汇的所有中文译名：“牙髓血运重建”“牙髓再血管化”“牙髓血管再生术”“牙髓活力重建”“牙髓再生”和“再生性牙髓治疗”。近20年国内外文献数量变化趋势显示：2001至2004年英文文献仅见个例报道；2005至2012年文献量缓慢增加；2013至2014年呈爆发式增长；2015至2020年文献增长缓慢，似进入平台期（图1）。中文文献较英文文献晚出现，第1篇是由金岩等^［6］于2004年发表的综述，随后文献的增长趋势与英文文献类似。

检索出的文献可分为病例报告、基础研究、临床试验、综述、指南五类。英文文献中，基础研究、病例报告和综述占主导，病例报告不断涌现，基础研究日新月异，综述内容更新快；但严格的临床随机对照研究较少，结果差异也较大。中文文献中，综述最多，反映出中国学者紧密关注该领域的学术动态；其次为基础研究，反映出国内研究急起直追之态势；临床试验研究文献直追同类英文文献总量，反映出我国开展临床试验的条件日趋成熟；病例报告数量最少（图2）。经过10余年研究和临床积累，2013年美国牙髓病学会（American Association of Endodontics，AAE）首次发布了指南，并分别于2016、2018、2021年予以更新^［2］。欧洲牙髓病学会（European Society of Endodontology，ESE）于2016年也发布了指南^［7］。最新AAE指南和ESE指南内容总体相似，内容的改变主要在根管内抑菌药物的应用、根管内血凝块的形成手段以及术后评价方法和指标。

从文献中可以看出再生性牙髓治疗的英文名称较多，所具内涵各有异同，中文译名更不统一，名称的多样性给研究和临床应用带来一定程度的概念混淆或操作混乱。

二、名称演变

再生性牙髓治疗的名称经历了一系列演变。描述这类治疗的英文名词有“revascularization”“regenerative endodontics”及“revitalization”。Iwaya等^［5］2001年开创性的第1篇文献中出现的名称为“pulp revascularization”，国内对这一术语的翻译有3种，钟小奕和陈文霞^［8］译为“牙髓血管再生术”，包志凡和陈旭^［9］译为“牙髓血运重建术”，文春媚^［10］译为“牙髓再血管化”。2007年，AAE的Murray等^［1］提出“regenerative endodontic procedures”，认为该名称更能准确反映在牙髓治疗中的组织工程学内涵，即以新生组织替代损坏的牙髓-牙本质复合体细胞乃至牙本质及根尖结构。在2013年AAE发布的第1份临床操作指南中仍采用这个名称，2020年AAE最新的牙髓病学术语汇编中也纳入同样的词汇。陈敏等^［11］引用“regenerative endodontic treatment”，并将其译为“再生性牙髓治疗”。2008年，Huang和Lin^［12］观察到接受此种治疗的患牙根管内形成的不只是血管，还包括其他软硬组织，故又提出“revitalization”。ESE唯一的指南中也使用了这一词汇^［7］。国内尚未见对此术语的译名，本文且将其称为“牙髓活力重建”。

上述名称涉及的临床操作主要指刺激根尖周组织出血并引入根管内形成血凝块的方法。近年来，又见到采用干细胞移植、细胞归巢等方法的临床尝试^{［13, 14］}。而干细胞移植法并不通过根尖引血，是将自体干细胞和生长因子、支架由冠方一并移植入根管，以期促进干细胞成牙本质向分化，进一步形成新生牙髓-牙本质复合体。细胞归巢法是在根管内植入生长因子与支架，搭建利于组织再生的环境后募集根尖周组织的自体干细胞自根尖孔归巢迁移进入根管内，以实现牙髓再生。虽然干细胞移植法和细胞归巢法与经典的血凝块法原理和操作均不相同，但均以实现牙髓再生为目的，故学者们也接受将这些方法统称为再生性牙髓治疗。为了表达的一致性，本文也沿用“再生性牙髓治疗”这一称谓。

三、生物学基础

再生性牙髓治疗亦需要具备组织工程学三要素，即种子细胞、支架和细胞因子。

（一）种子细胞

参与牙髓再生的种子细胞主要包括牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）、根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）及炎性根尖周前体细胞（inflammatory periapical progenitor cell，iPAPC）^{［15, 16］}。通过分析文献中的病例，发现临床诊断为牙髓坏死、根尖周炎、根尖周脓肿的年轻恒牙患牙根管中可能有生活牙髓残留。年轻恒牙根尖尚存根尖牙乳头，其中的SCAP具有较强的增殖和牙源性分化能力。当DPSC已全部坏死，SCAP则成为再生性牙髓治疗最具潜力的种子细胞。PDLSC和BMMSC被视为再生性牙髓治疗的可能供者，当根尖周组织受到机械刺激出血时可能触发这些干细胞的释放。iPAPC则代表根尖周炎患牙另一重要种子细胞的潜在来源。上述干细胞在适宜条件下均可分化为成牙本质细胞样细胞，但对其鉴定和表征仍具挑战，因为这些细胞缺乏成牙本质细胞所具有的特定位置、圆柱状极化细胞体以及进入牙本质小管的细胞突等典型形态，也尚无可用于鉴定的特异性标志物。组织学检查发现再生性牙髓治疗患牙根管内形成的组织多为牙骨质样和骨样组织，原因之一可能是炎症环境不利于根管内存活的DPSC或根尖部SCAP向成牙本质方向分化；另外也可能随着牙髓坏死或根尖周组织炎症，DPSC或SCAP已坏死，而存在于根尖周部位的PDLSC、BMMSC或根尖周病变内的iPAPC更趋于向成牙骨质或成骨分化^［17］。

（二）支架

适当的支架可以给种子细胞提供正确的位置，调节其分化、增殖，通过促进营养和气体交换提供有利于细胞新陈代谢的生物学条件。再生性牙髓治疗的支架主要有自体血凝块、自体血小板浓缩物以及生物材料支架等。目前临床常用的主要为自体血凝块和血小板浓缩物。

1.自体血凝块：刺激根尖周组织出血诱导根管内血凝块形成是目前再生性牙髓治疗中获取支架的主要方法，临床操作相对简单。血凝块不仅可以使细胞表面的整合因子与纤维块黏附，选择性吸附细胞，还包含丰富的促进细胞功能性分化和硬组织形成的生长因子。但血凝块也存在一些问题，如不易递送、机械强度不足、生物降解不可控以及不易与生长因子结合。此外，血凝块包含大量造血细胞，这些细胞最终会死亡并释放毒性细胞内酶进入微环境，不利于干细胞存活^［18］。

2.血小板浓缩物：替代血凝块作为支架的内源性材料有富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）和浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）。此类血小板浓缩物由自体全血离心而得，具有自体源性、易制取、可降解、可形成三维纤维支架等特点，较血凝块含有更丰富的生长因子，更利于干细胞迁移、增殖和分化，进而形成基质并矿化。从临床病例报道中也可以看出自体植入支架的不足，如生长因子呈多样性、不易成形、缺乏降解控制能力以及机械强度弱，无法支撑冠部修复；且其制备需要特殊设备和药物，需抽取患者自身静脉血，治疗费用较高^［18］。

（三）生长因子

再生性牙髓治疗中所需的生长因子主要存在于牙本质基质中，它们可通过基质的脱盐、细菌酸化、乙二胺四乙酸冲洗液、氢氧化钙、粘接剂中的酸蚀剂以及硅钙类生物材料（如三氧化矿物凝聚体和生物陶瓷）的刺激而溶解释放。其中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）可促进细胞迁移；PDGF和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）调节血管的生成；TGF-β1、FGF2、VEGF和胰岛素样生长因子刺激细胞增殖；骨形态发生蛋白和FGF2促进牙本质形成^［17］；非胶原蛋白如牙本质基质蛋白和牙本质磷蛋白，以及糖胺聚糖如硫酸软骨素和硫酸皮肤素，也可促进牙本质的形成^［19］。再生性牙髓治疗中也可添加外源性生长因子，有临床试验将重组血小板衍生生长因子放入根管，以增强内源性牙本质基质生长因子诱导牙髓-牙本质复合体再生的作用^［20］。

四、临床治疗中的适应证考量及操作关键

再生性牙髓治疗首选患牙为年轻恒牙。涉及临床操作的研究中对病例的年龄均有统一要求，2001至2020年的190篇病例报告共包含年轻恒牙701颗，其中90.7%的患者年龄在17岁及以下。对病例患牙疾病构成的分析显示，425颗已知病因的患牙中外伤占62.4%（265/425），龋齿占9.9%（42/425），畸形中央尖或畸形舌侧窝占26.1%（111/425）。临床随机对照研究中病例的纳入标准为：患者年龄8~15岁，患牙根尖孔直径大于1 mm，牙髓坏死，伴或不伴根尖周炎。关于适应证，2016年ESE的指南中规定患牙牙根未完全形成，牙髓坏死，无论有无根尖周病变^［7］；2021年AAE的指南除明确指出牙髓坏死的患牙须为根尖发育尚未完成外，还进一步补充了患牙无需桩核冠修复、患者及家属依从性良好、患者对完成治疗所用药物和抗生素不过敏等条件^［2］。Cvek^［21］对牙根发育程度进行了分期，可据此判别治疗的时机和指征。Ⅰ期：牙根形成少于1/2，根尖孔开放；Ⅱ期：牙根形成1/2，根尖孔开放；Ⅲ期：牙根形成2/3，根尖孔开放；Ⅳ期：牙根发育接近完成，根尖孔开放；Ⅴ期：牙根发育完成，根尖孔闭合。其中牙根发育为Ⅰ~Ⅲ期的患牙可采取再生性牙髓治疗，Ⅳ期患牙可选择再生性牙髓治疗或根尖屏障术，而Ⅴ期患牙则需行根管治疗。

由以上再生性牙髓治疗的适应证可以看出，临床操作有两个关键环节，一是清除根管内的感染，二是提供良好的再生环境。这两个环节在ESE和AAE的指南中均有体现^［2，7］，强调的操作步骤为：①尽量不对根管壁做机械预备或仅最小限度切削管壁牙本质；②1.5%次氯酸钠和17%乙二胺四乙酸大量冲洗；③三联抗生素糊剂（triple antibiotic paste，TAP，包括环丙沙星、甲硝唑、米诺环素）或氢氧化钙糊剂根管消毒；④通过根尖孔刺激根尖周组织引血入根管形成支架；⑤以硅钙类生物活性材料覆盖血凝块；⑥有效密封冠部开口。清除感染可能带来的细胞和组织损伤与组织再生所需要的生物学环境有时是相悖的，这也成为临床操作的难点，直接影响治疗效果。操作中不对根管壁切削，虽避免了玷污层阻塞牙本质小管，但管壁上滞留的细菌生物膜是治疗失败的主要原因。为去除生物膜，化学预备和根管消毒显得尤为重要，而以低浓度药液进行冲洗的有限抑菌效果使人们聚焦于根管内封药这一最后的消毒手段。Diogenes等^［16］在其对2001—2013年发表的病例报告文献回顾中指出有51%的病例使用TAP，37%的病例使用氢氧化钙；在临床随机对照研究中，TAP及氢氧化钙均为常用的根管封药。这两种糊剂各有利弊，如细菌对抗生素的耐药性、抗生素致敏原性、氢氧化钙降低根管壁机械抗力等问题的存在都促使研究者寻找更理想的根管消毒策略^［22］。

五、临床疗效评价与愈合状态

再生性牙髓治疗除可防治根尖周炎外，更重要的目的是重建牙髓血运，促进牙根持续发育。AAE指南中描述的治疗目标如下^［2］：一级目标，临床症状消除，骨质愈合，影像学检查根尖透射影面积减小或消失；二级目标，根管壁厚度和（或）根长增加；三级目标，牙髓活力测试呈现反应。

（一）临床疗效评价指标

近5年的前瞻性临床研究显示，再生性牙髓治疗的成功率为83.3%~100%^{［23, 24, 25］}。常用的疗效评价指标为：①患牙无临床症状；②影像学显示根尖周病变愈合或减小；③患牙牙根继续发育，表现为牙根增长，根管壁增厚，根尖孔闭合。治疗后患牙症状缓解及疾病痊愈可通过临床表现和影像学检查进行评估，但临床上要获得牙根发育和牙髓活力的证据仍具有挑战。

1.牙根继续发育：牙根继续发育是再生性牙髓治疗疗效评价的一个必要指标。但病例报告中对是否存在牙根持续发育或根尖孔闭合通常用的是主观和非量化的描述，这是因为年轻患者颌骨发育迅速，难以获得标准化X线片。也有研究通过对非标准化根尖片进行数字校正，再量化牙根长度和宽度的变化，结果表明再生性牙髓治疗可使根管壁厚度平均增加25.0%，最高达到35.5%，但根管壁增厚通常仅限于根中部和根尖，尚无根颈部管壁厚度增加的表现；根长平均增加11.3%，最高达到14.9%；而根尖诱导成形术则不会促进牙根进一步发育^［26］。

2.牙髓活力：目前约有50%的病例报道显示患牙牙髓活力恢复，患牙对电活力测试能作出反应者较冷测试更普遍。患牙对冷测试或电测试出现反应，但无症状和体征，说明其根管中可能存在功能组织^［26］。文献中也有报道患牙根尖周炎愈合并有明显的牙根发育，但无牙髓活力反应的情况，患牙冠方修复体的深度和根管内的钙化程度均可影响牙髓活力测试结果。因此，术后患牙出现牙髓活力反应是理想的结果，缺乏反应也暂不视为失败^［27］。

（二）术后根管内容物的组织学表现

牙髓再生的组织生理学理想过程是生成非矿化的牙髓组织和矿化的牙本质。但目前对拔除的经治人牙或犬牙行组织学观察发现，根管内新生物的结构混乱无序，呈现为牙骨质样组织、牙周膜样组织和骨样组织，含少量细胞纤维结缔组织、成纤维细胞和血管。近年学者们开始探讨影响根管内生成物的因素，Verma等^［28］在雪貂的实验中发现细菌残留导致根管内类牙本质的硬组织含量明显减少，坏死组织占据根管的主要空间。Torabinejad 等^［29］在保留雪貂根尖区1~4 mm健康牙髓的实验组中发现根管内形成了与正常牙髓相似的活性组织。2020年Zaky等^［30］对比格犬的动物实验发现，根管内容物形成的类型和质量可能受根尖区炎症的影响，有根尖周炎的患牙根管内无细胞长入，且缺乏骨样或牙骨质样的板层样结构。

（三）治疗失败的原因分析

最主要的失败原因是根管系统的感染和外伤后的牙根吸收^［31］。根管内感染滞留主要是操作因素所致，如前述根管未做机械预备、根管冲洗受限以及根管封药不到位，均可使根管不能达到彻底消毒。根管系统的再感染，一方面可能为冠方渗漏；另一方面，外伤（如外伤牙）造成的根尖周组织血管断裂可影响根尖部血运，丧失清除感染和修复再生的条件。

六、科学研究方向和研究转化的初步探索

牙髓再生的研究进展迅速，近年关注的热点由根尖引血法转为干细胞移植法或干细胞归巢法。临床研究也将集中于将基础研究结果转化为临床再生性牙髓治疗的可行性药物和可操作的简易手段。

（一）基于干细胞移植的方法

遵循组织工程学原则，可将干细胞、生长因子、支架共同移植到根管内，创建牙髓再生的条件。早在2000年，学者们就证明了将有干细胞移植的牙片、牙本质柱甚至整个牙根埋置于免疫缺陷小鼠皮下，可获得组织工程学概念的再生牙髓样组织^［32］。基于干细胞移植法的临床研究最早见于2017年Nakashima等^［13］对成人恒牙不可复性牙髓炎病例进行的临床试验，2018年Xuan等^［33］将脱落乳牙牙髓干细胞移植到牙髓坏死的年轻恒牙根管内，实现了牙髓再生。在临床实际操作中，干细胞移植法尚需面对诸多科学挑战，如自体干细胞的可用性，干细胞在分离、储存、扩增、培养等处理过程中可能遭遇的污染，生物制品的研发；还可能要克服对高精设施的需求、政府监管政策以及临床医师对技术的掌握等困难。

（二）基于细胞归巢的方法

所谓细胞归巢是将含有趋化因子等信号分子的支架材料注入根管内，通过对内源性根尖周组织中的干细胞及支持血管向根管内趋化，使其迁移、增殖和分化，最终形成再生的牙髓组织。最早的报道见于2010年Kim等^［14］将碱性成纤维细胞生长因子、VEGF结合在胶原支架材料上，再将根管内承载该支架的人离体牙植入大鼠皮下组织，3周后观察到在根管内形成了牙本质样硬组织和血管化、神经化组织。后续涌现出一些关注于SCAP迁移、增殖和定向分化的体外研究，这些探索机制的研究支撑着将细胞归巢技术用于体内试验^{［34, 35］}。对于感染根管诱导根尖周病变的动物实验^［36］，有研究在犬牙内用载有基质细胞衍生因子-1的丝蛋白支架填充根管，3个月后组织切片显示根管内形成了含有血管和矿化物的新生牙髓组织，遗憾的是再生的矿化组织中未发现成牙本质细胞样细胞。时至今日，这种不含成牙本质细胞样细胞的血管化疏松结缔组织是否能称为再生的牙髓组织仍受质疑。

与基于细胞移植的方法相比，细胞归巢法因无需在体外进行干细胞的分离和扩增，临床操作更简易。Zhujiang和Kim^［20］对牙髓坏死的下颌磨牙实施细胞归巢再生性牙髓治疗的临床病例报道显示，在患牙根管内注入负载重组血小板衍生生长因子的胶原支架后，患牙的根尖周炎不但愈合，还观察到牙根继续发育。目前尚未见到严格的临床随机对照研究，现有的临床资料也不能清楚地证明根管内干细胞的真正来源。

再生性牙髓治疗经历了20年的发展，科学理念和临床实践均取得了长足进步。但对于血运重建、再血管化、细胞移植、细胞归巢等理论内涵和技术操作，各项研究尚存分歧和差异。实际上，从科学的角度看，再生性牙髓治疗所包含的这些方法又可归为两大类，即基于细胞植入法和无细胞植入法。前者仅指干细胞移植，后者包括血运重建和细胞归巢。近年，我国的牙髓病学学者们也高度关注这一话题，从不同角度阐释该领域的进展^{［37, 38, 39］}。时至今日，仍有许多科学问题未认识、未揭示、未解决，临床探索和尝试尚缺乏完善、成熟的科学理论体系支撑和有说服力的实验证据证实，临床和组织学评价指标也未取得共识。目前，还不具备无限制扩大临床适应证广泛开展再生性牙髓治疗的条件，仍需对其机制进行更多、更深入的研究，以求真正实现牙髓-牙本质复合体再生。毫无疑问，再生性牙髓治疗的出现是一种具有空前意义的创新，使人类在追求保存天然生物器官的道路上看见了曙光，也是未来牙髓治疗发展方向的终极目标。