牙髓炎的活髓保存及再生治疗新进展：从基础到临床

牙髓炎的活髓保存和再生治疗一直是牙髓生物学领域的研究热点和前沿，目前临床上针对成人龋病露髓的可复性牙髓炎和冠髓部分坏死的不可复性牙髓炎的主要治疗方式仍是去髓术或根管治疗术。近年随着牙髓炎治疗方式的改进和治疗水平的不断提高，成人龋病露髓的可复性牙髓炎和冠髓坏死的不可复性牙髓炎可以保存活髓并有较好的长期疗效^［1］。牙髓炎活髓保存治疗成功的生物学基础是牙髓的免疫防御和修复功能。牙髓固有免疫在牙髓防御细菌入侵和启动后续的修复反应中均发挥了重要作用。牙髓炎的诊断是牙髓炎活髓保存治疗成功的重要因素，近年来关于炎症分子标志物的研究有利于更准确诊断牙髓炎的严重程度。盖髓剂一直是牙髓炎治疗领域的研究热点，其在牙髓炎保存治疗中发挥了重要作用。国内外学者对氢氧化钙、化学分子、激光、生物活性因子、三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）及其他类似MTA的硅酸钙生物活性材料等进行了大量动物实验和临床研究；对根髓部分坏死的牙髓炎治疗，除根管治疗术外，再生性牙髓治疗（包括牙髓血运重建、细胞归巢和牙髓干细胞移植牙髓再生）也成为研究的热点，一些病例取得了较好的临床效果。本文的目的是介绍近年来牙髓炎活髓保存治疗和再生性牙髓治疗的相关研究进展，以期为临床牙髓炎的治疗提供参考。

一、牙髓炎的活髓保存治疗

（一）生物学基础

1.牙髓的免疫防御功能：龋病在发展进程中，龋损中的致龋菌或其毒性产物可通过牙本质小管进入牙髓，牙髓牙本质复合体为抵抗细菌及其毒性产物入侵，首先会启动牙髓免疫防疫反应，包括固有免疫和获得性免疫。固有免疫是牙髓牙本质复合体防御感染和应激的第一道屏障，其中成牙本质细胞、树突细胞、牙髓细胞和内皮细胞等细胞表面表达的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）是牙髓固有免疫的重要组成成分^［2］，它们通过识别不同的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）介导相应的免疫反应，释放大量抗菌因子、促炎细胞因子和趋化因子，募集并激活免疫细胞，发挥免疫防御作用^［3］。另外，成牙本质细胞、树突细胞等细胞表面也表达主要组织相容性复合体Ⅱ，可以将抗原呈递给T淋巴细胞、B淋巴细胞启动获得性免疫反应。近年发现Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体在牙髓固有免疫和牙髓炎发生发展过程中发挥重要作用^［3］。

TLR是细胞表面的一种PRR，TLR对于PAMP的识别及下游信号通路激活是机体免疫应答的重要途径之一，TLR信号通路活化是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。TLR2、TLR4和TLR9可分别特异性识别革兰阴性菌胞膜组分脂多糖、革兰阳性菌胞膜组分脂磷壁酸和细菌DNA，激活成牙本质细胞、牙髓细胞和牙髓干细胞内相应信号通路，释放多种抗菌因子、炎症因子和趋化因子参与牙髓固有免疫反应^［3］。一些研究发现TLR2和TLR4在龋病和炎症牙髓组织中的表达显著升高，提示其参与牙髓免疫防御和牙髓炎症的发生发展^［3］。本课题组研究发现，TLR9和TLR4可特异性表达于成牙本质细胞和牙髓干细胞中，通过核因子-κB和丝裂原激活蛋白激酶信号途径，调控细胞外基质蛋白的表达，表明TLR在调控第3期牙本质形成过程中发挥了重要作用^{［4, 5, 6］}。

核苷酸结合寡聚化结构域蛋白（nucleotide-binding oligomerization domains，NOD）和NOD样受体蛋白3（NOD-like protein 3，NLRP3）属于胞质内PRR家族。与TLR4识别细胞表面的成分不同，NOD1和NOD2可特异性识别胞内的革兰阳性和革兰阴性细菌细胞壁的肽聚糖，正常牙髓中多种细胞表达NOD1和NOD2，在牙髓炎症时NOD1和NOD2显著升高^［3，7］。NLRP3被认为是一种炎症小体，由多种蛋白质组成的胞质内复合体，含有凋亡相关微粒蛋白，可由多种PAMP刺激形成，炎症小体进一步激活胱天蛋白酶-1，促进白介素（interleukin，IL）-18和IL-1β的释放和细胞程序性死亡，参与炎症反应，是固有免疫的重要组成部分，研究发现NLRP3在不可逆性牙髓炎牙髓中的表达量显著高于正常牙髓和可复性牙髓炎^［3，8］。TLR4活化后可以通过核因子-κB信号通路增强NOD2和NLRP3的表达，TLR4、NOD2和NLRP3在牙髓炎发生中存在协同效应^［3，7］。总之，NOD1、NOD2和NLRP3在牙髓组织和牙髓炎症中的表达变化表明其参与正常牙髓牙本质复合体的固有免疫反应，在识别抵御病原微生物的宿主免疫防御中起重要作用，参与牙髓炎的发生发展过程。

2.牙髓的修复功能：致龋菌入侵牙髓后，牙髓免疫防御反应可激活帮助消灭细菌，牙髓也会启动修复反应，形成第3期牙本质，隔离细菌的入侵。龋损距离牙髓越近，牙髓炎症越重。根据龋坏的牙体组织与牙髓之间是否存在修复性牙本质，近髓龋坏可分为深龋和极深龋两种，前者龋坏近髓部分与牙髓之间存在一层坚硬的修复性牙本质，而后者龋坏近髓部分与牙髓之间不存在修复性牙本质，龋坏已侵入牙髓^［9］。由于牙髓具有免疫防御和修复功能，导致牙髓表现出的临床症状及X线检查结果与牙髓病理表现并不一致。一些深龋可表现为不可复性牙髓炎症状，而极深龋也可表现为可复性牙髓炎症状。因此，对龋坏导致的牙髓炎的诊断和治疗还需要对牙髓状态进行更准确的判定。

（二）牙髓炎症状态的评估和诊断

牙髓炎患牙经治疗能否成功实现活髓保存，对牙髓炎症状态的评估和准确诊断非常重要。由于牙髓炎发生时临床症状只有疼痛反应，目前的可复性牙髓炎和不可复性牙髓炎诊断并不能完全准确反映牙髓的真实状态。临床诊断为可复性牙髓炎和不可复性牙髓炎的病例中，与牙髓实际病理组织状态一致的概率分别为96.6%和84.4%^［10］。Ricucci等^［11］研究发现，14%~60%的不可复性牙髓炎可能无症状，可复性和不可复性牙髓炎的炎症可能仅局限于冠髓，根髓正常。近年对牙髓炎评估的研究有一定进展，也出现了新的牙髓炎诊断分类。

1.通过近髓牙本质评估牙髓炎状态：去龋过程中观察近髓牙本质的感染程度有助于评估牙髓炎状态，如果牙本质感染轻，范围小，则轻度牙髓炎的可能性大。如果牙本质感染重，范围大，则重度牙髓炎的可能性大。另外，评估去龋后剩余牙本质厚度有助于判定牙髓炎症状态。Reeves和Stanley^［12］研究发现，当剩余牙本质厚度大于1.0 mm时，活髓保存治疗后5%的病例发生重度牙髓炎症反应；剩余牙本质厚度为0.5~1.0 mm时，35%的病例发生重度牙髓炎症反应；剩余牙本质厚度小于0.5 mm时，60%的病例发生重度牙髓炎症反应。

2.通过测定分子标志物评估牙髓炎症状态：牙髓炎发生发展过程中，牙髓组织可产生大量的细胞因子、炎症介质、神经肽和蛋白酶，可以通过测定这些分子的蛋白和信使核糖核酸的表达变化评估牙髓炎症状态^{［13, 14］}。Zanini等^［14］发现肿瘤坏死因子α、IL-8和基质金属蛋白酶9在不可复性牙髓炎牙髓中的表达量显著增加，可作为牙髓炎的分子诊断标志物。测定这些分子标志物可采用非侵入和侵入两种方式，前者需要收集患牙龈沟液，后者需要收集牙本质液和牙髓血液。龈沟液易受牙周组织和根尖周组织的影响，牙本质液难以收集到足够检测的量，目前临床可行的方法仍是检测牙髓血液，需要暴露牙髓。

3.通过牙髓出血情况评估牙髓炎状态：牙髓发生炎症时，牙髓组织细胞可释放大量细胞因子和炎性因子，导致牙髓血管扩张、渗出增加，因此牙髓暴露损伤后，出血量显著增加。研究发现，正常或可复性牙髓炎的牙髓暴露后出血量较少、颜色鲜红，止血后5 min内可以停止出血；不可复性牙髓炎的牙髓暴露后出血量较大、颜色暗红，止血后5 min内无法停止出血^［15］。另外，牙髓暴露后，牙髓颜色灰白、不出血或髓腔化脓，则表明冠髓已弥漫性坏死，甚至已波及根髓^［16］。通过牙髓出血情况评估牙髓炎症状态在活髓保存治疗中有较强的指导意义，是目前临床较常用的方法。

4.牙髓炎新的诊断分类：2017年Wolters等^［17］提出新的牙髓炎分类，将牙髓炎分为初期牙髓炎（initial pulpitis）、轻度牙髓炎（mild pulpitis）、中度牙髓炎（moderate pulpitis）和重度牙髓炎（severe pulpitis）。初期牙髓炎表现为患牙冷刺激一过性敏感，无延时痛，无自发痛，叩痛（-），病理学表现为牙髓血管充血，治疗方法为间接盖髓术。轻度牙髓炎表现为患牙冷、热刺激痛和甜食敏感，疼痛可持续20 s，叩痛（+/-），病理学表现为局部性冠髓炎症，治疗方法为间接盖髓术。中度牙髓炎临床表现为强烈的冷刺激痛，持续时间超过几分钟，自发钝痛，叩痛（+/++），需要口服止痛药缓解；病理学表现为更大范围的局限性冠髓炎症、部分坏死；治疗方法为冠髓切断术（部分或全部）。重度牙髓炎临床表现为强烈的冷热刺激痛，持续时间长；自发痛严重，跳痛、锐痛、夜间痛、叩痛（++/+++）；病理学表现为冠髓广泛炎症，可能已波及根髓；治疗方法为根髓切断术/去髓术。此分类法结合了牙髓炎临床症状和病理表现，更符合牙髓炎的实际状态，有利于牙髓炎的正确诊断和治疗。最近Careddu和Duncan^［18］根据Wolters的牙髓炎分类和美国牙体牙髓病学会（American Association of Endodontists，AAE）的牙髓炎分类，对有症状的极深龋和深龋进行部分冠髓切断术治疗，结果显示牙髓保存治疗的1年总成功率为90%，研究表明Wolters新分类较AAE分类更有利于牙髓炎的诊断和治疗。目前关于Wolters牙髓炎分类的临床研究较少，上述结论还需更多临床对照试验进一步验证。

（三）盖髓剂与活髓保存治疗

1.氢氧化钙：活髓保存治疗成功的一个重要因素是盖髓剂的应用。几十年来，氢氧化钙被认为是维持牙髓活力的标准制剂，是盖髓术临床最常用的材料，是评估新盖髓制剂的金标准。但是，近期大量研究发现氢氧化钙直接盖髓术长期疗效不佳^{［19, 20］}。Cushley等^［19］荟萃分析研究发现氢氧化钙用于直接盖髓术4~5年的成功率仅为56%。Barthel等^［20］研究发现，利用氢氧化钙行直接盖髓，10年后发生牙髓坏死需行根管治疗或拔除的病例接近75%。

2.亲水性硅酸钙类生物活性材料：目前种类较多，包括MTA、Biodentine和iRoot BP Plus等，临床效果类似。

（1）MTA：是1993年由Lee等^［21］首次报道的一种牙髓治疗材料，其成分主要为硅酸三钙、硅酸二钙、铝酸三钙、铝酸四钙及少量三氧化二铋等。大量的细胞体外实验和动物实验证明，MTA具有良好的封闭性、生物相容性、诱导成骨性、X线阻射性以及杀菌和抑菌功能^［22］。动物实验发现MTA盖髓后牙髓炎症反应轻、形成的修复性牙本质桥与正常牙本质桥类似，厚且均一^［22］。MTA的基础研究效果推动了其在临床活髓保存治疗中的应用，大量研究表明MTA用于直接盖髓术和牙髓切断术均有较好的临床效果^{［21, 22, 23］}。Linsuwanont等^［23］回顾性研究发现，不可复性牙髓炎成熟恒牙行MTA牙髓切断术后5年成功率为84%，不可复性牙髓炎伴根尖周阴影的治疗成功率为76%。与氢氧化钙相比，动物实验研究发现MTA用于直接盖髓术和牙髓切断术的牙髓炎症反应更少、溶解度更低、形成“隧道形缺陷”较少且可形成更均质的牙本质桥，力学强度较高，与牙本质边缘密合性更佳^［22］。Mente等^［24］通过10年回顾性研究发现，MTA用于直接盖髓术的成功率为80.5%，而氢氧化钙的成功率仅为59%，两者差异有统计学意义。

（2）其他硅酸钙类生物活性材料：包括BioAggregate、iRoot BP Plus（Innovative Bioceramix，加拿大）、Biodentine等，细胞实验研究发现他们具有与MTA类似的生物学特性和促进牙髓细胞和牙髓干细胞分化形成成牙本质细胞样细胞的功能^［22］。在直接盖髓术和牙髓切断术的临床效果方面，Biodentine和MTA并无显著差异^［25］。iRoot BP Plus是一种液压预混合生物陶瓷材料，具有与MTA类似的作为根尖倒充填材料和盖髓材料的功能，且不导致牙齿变色，其在临床中的应用逐渐增加^［26］。

3.生物活性分子：除氢氧化钙和硅酸钙材料外，生物活性分子及生物活性分子结合水凝胶或缓释材料形成的新型盖髓材料在直接盖髓术或牙髓切断术动物实验中也取得了较好的牙髓愈合效果^［27］。这些生物活性分子研究较多的有生长因子如转化生长因子-β1、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-7和成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2），牙本质基质蛋白成分如骨涎蛋白、牙本质基质蛋白-1和牙本质涎蛋白等。这些生物活性分子的载体包括胶原、壳聚糖、羟基磷灰石、明胶水凝胶微球、壳聚糖双层膜、聚乳酸共乙醇酸微球等。但是，研究这些新型盖髓材料所使用的实验动物多为大鼠和狗，且观察时间一般较短（2周至6个月），缺乏长时间的疗效观察。另外，这些生物活性分子在临床应用有较多限制，还需要进一步的临床试验验证其长期疗效。

二、牙髓炎的再生修复治疗

当牙髓炎症导致牙冠局部的牙髓坏死波及全部牙髓时，患牙的牙髓活性可显著降低甚至完全丧失。对于根尖未发育完全的年轻恒牙，临床常采用根尖诱导成形术或根尖屏障术治疗，对根尖发育成熟的恒牙常采用根管治疗术。根尖诱导成形术需要患者多次治疗，封药时间过长可降低牙齿抗力，根尖诱导成形术存在根管钙化甚至根管闭锁等并发症，导致后续根管治疗困难。根尖屏障术随着MTA等硅酸钙生物陶瓷材料的应用，可以取得较好的临床根尖病变愈合效果，但牙根无法继续完成发育。根管治疗术的牙齿去髓后失去了牙髓免疫防御功能及形成继发性牙本质和第3期牙本质的能力，使牙齿易被细菌感染，牙本质胶原纤维因老化、崩解导致牙齿抗力下降而发生冠折或根裂，最终导致牙齿存活时间减少。

近10余年，由于再生牙髓病学研究取得了显著进步，牙髓再生治疗也成为不可复性牙髓炎的一种治疗选择。目前临床牙髓再生的治疗方法主要包括牙髓血运重建术、细胞归巢和牙髓干细胞移植牙髓再生^［28］。

1.牙髓血运重建术：1961年Ostby^［29］提出根尖诱导出血至根管形成血凝块，最后根管内有新生组织长入。2001年Iwaya等^［30］首次提出牙髓血运重建术，可诱导未发育的牙根继续生长，根管壁增厚，同时根尖孔闭合。2011 年Torabinejad和Turman^［31］将富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）替代血凝块进行血运重建术，术后5个月患牙根尖阴影消失、根管壁增厚、根管长度增加以及根尖孔闭合。其他自体血小板浓缩物包括富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）和浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF），也可发挥类似PRP的作用^［32］。PRF衍生物的牙髓血运重建术不需要根尖刺激出血，根管内形成的新生组织优于血凝块的效果^［32］。

目前研究发现，无论自体血还是PRF衍生物的牙髓血运重建术，根管内形成的新生组织并不理想，形成的长度很难达到根管全长，形成的新生组织主要是骨样、牙骨质样、牙周膜样，而不是牙髓样组织；但牙髓血运重建治疗后根尖周炎的根尖愈合成功率可达91%~94%^［32］。

2.细胞归巢：2010年，Kim等^［33］首先提出牙髓再生的细胞归巢概念，包含细胞募集和细胞分化两个步骤。根管内植入不含干细胞的混合生长因子支架材料。生长因子趋化诱导根尖外干细胞进入根管内，进一步在细胞支架中分化为分泌基质的成熟细胞。Kim等^［33］研究发现，将FGF-2和血管内皮生长因子2输送到根管中，可生长出牙髓样组织。在一项体外实验中，研究者在离体磨牙根尖处放置细胞-胶原复合体，在牙本质基质蛋白作用下原位诱导细胞迁移、分化，模拟人体内的细胞归巢途径诱导牙髓再生，并观察到牙髓样组织的产生^［34］。其他细胞归巢研究的生长因子还包括BMP-2、血小板衍生生长因子、神经生长因子、BMP-7和粒细胞集落刺激因子等，文献报道动物实验可取得较好的牙髓再生效果^［35］。但是这些生长因子大部分没有获得临床应用批准，生长因子的制备、提纯等也需要在完全符合药品生产质量管理规范国际标准的生物实验室中进行。因此，细胞归巢应用于牙髓再生仍有很长的一段路要走。

3.牙髓干细胞移植牙髓再生：2000年人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，hDPSC）在人恒牙牙髓中被分离出来，它是一类具有高增殖、分化潜能，几乎在任何年龄段牙髓中均有存在的干细胞^［36］。同时，牙髓干细胞对感染有一定抵抗能力，在根尖周炎与炎症牙髓中也有存在，被认为是最具可行性、最有前途的牙源性干细胞^［37］。

大量研究已证明，hDPSC具有与骨髓间充质细胞相近的多向分化潜能，如成脂分化、成骨分化、成神经分化和成血管分化^［37］。在一项hDPSC长期培养的研究中，研究结果证明直至第14代时，hDPSC仍具有较高的增殖能力，可用于再生医学和组织工程^［36］。使用粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）可以诱导牙髓干细胞形成动员的牙髓干细胞，其共同应用在犬去髓牙中显示出牙髓样组织的再生^［35］。研究发现，基质细胞衍生因子-1同样可以发挥类似G-CSF的作用。关于hDPSC的研究较少，Nakashima和Iahara^［38］研究显示，5名志愿者不可复性牙髓炎去髓后，植入G-CSF诱导动员的自体人牙髓干细胞，24周后可见牙髓样组织形成，牙髓活力测试类似正常牙齿。Xuan等^［39］利用自身乳牙牙髓干细胞，在外伤坏死的年轻未发育恒牙中形成牙髓样组织，牙髓电活力测试阳性，2年临床观察牙根继续发育完成。Meza等^［40］在病例报道中利用牙髓炎牙齿的牙髓干细胞和患者自身含白细胞的富血小板纤维蛋白移植到根管预备后的牙齿，6个月和3年时回访显示，患牙冷热温度测试和电活力测试结果均类似于正常邻牙，表明患牙形成了正常的牙髓组织。由于存在伦理限制、手术条件要求高、后期感染和成瘤风险、临床费用高等诸多限制，加上牙髓缺失对患者影响较小可通过根管治疗术替代，因此未来牙髓干细胞移植牙髓再生的大规模临床推广难度仍较大。

三、展望

随着活髓保存治疗基础研究和临床试验的显著进展，对牙髓炎的诊断、分类和治疗方法更加细致，以前许多不能保存的患牙牙髓通过新的技术和方法可以长期保存。由于越来越多的活髓保存治疗基础研究已被转化为临床应用，未来随着这些理论的传播和技术的推广，龋坏牙髓暴露和不可复性牙髓炎的治疗格局将得到改变，更微创、更经济、技术难度更低的活髓保存治疗将部分替代根管治疗术，患者的患牙将得到更长久的保留。随着再生牙髓病学基础研究的进一步发展，根髓部分或弥漫性坏死的牙髓炎也可通过牙髓再生技术实现牙髓再生，未来随着更大规模的临床对照试验，更多的基础研究可被转化为临床应用，牙髓炎的治疗或许可以不再需要根管治疗术。