牙釉质仿生矿化研究进展

龋病是造成牙齿结构破坏的主要原因，初期表现为牙釉质无机成分脱矿，持续进展则牙釉质及深层结构崩解破损成洞。牙釉质不可再生及自我修复。对于牙齿结构破坏，目前主要用树脂或陶瓷材料与剩余牙体组织粘接进行替代修复，但因难以复原天然牙的高度有序的规律层级结构，目前的修复体在微观生物学和力学性能方面仍有较大局限性，使用过程中难免出现继发问题，而且长期以来粘接界面的微渗漏问题也难以解决，这些不足促进牙齿硬组织仿生修复的发展。

仿生矿化（biomimetic mineralization）是将生物矿化的机制引入材料制备过程，在体外模拟机体微环境，通过分子仿生合成和分子自组装等技术构建生物矿化的微观分子环境，以基质材料为模板形成无机矿化物，并控制无机矿化物的形成过程及组成，从而制备出具有独特微观结构及优异的生物学和理化性能的复合材料^［1］。仿生矿化在硬组织缺损修复材料的研发中具有潜在优势。在体外实现羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶体沿特定方向有序生长形成规律的釉柱结构，是牙釉质仿生矿化成功的关键。现对牙釉质仿生矿化修复最新进展进行综述。

一、再矿化策略与无机仿生修复材料

（一）表面再矿化产品

根据牙釉质无机成分及脱矿与再矿化的化学平衡原理，可直接在局部提供高浓度无机离子或原料颗粒，促进HA晶体的化学平衡向再矿化方向倾斜。这些无机原料可为氟、钙、磷、磷酸钙盐或纳米磷酸钙盐颗粒等^［2］。磷酸钙盐可有多种形式，包括HA及纳米HA晶体、无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP）、三磷酸钙、八磷酸钙等^{［3, 4, 5］}。再矿化策略帮助维持牙齿原有结构，避免龋洞形成，进而节省后期治疗费用，是口腔预防领域的重要方向。目前，表面再矿化机制已较成熟，出现多种再矿化产品，例如经典的氟化物产品（牙膏或漱口水、凝胶或泡沫、保护漆等），新生代的提供钙、磷离子的生物活性玻璃产品或口香糖^{［6, 7］}，提供磷酸钙盐的牙膏类产品、氟保护漆或修复材料等^{［8, 9, 10］}。虽然多种表面再矿化产品效果确切，但其仅适用于尚未形成龋洞的牙釉质脱矿的修复，尚难以完全复原脱矿牙釉质表面，临床效果仍有待提高。

（二）再矿化修复膏

日本有学者用无机离子溶液及改良的HA晶体成分等，自制膏状物修复早期釉质龋^［10］，可在牙釉质表面形成线性排列的、结构及组成均类似牙釉质的纳米HA晶体，并可在15 min内完成对牙釉质微小缺损的修复。这是临床在口内用无机化学方法再矿化修复牙釉质的典型范例，可替代修复体填充技术完成早期微小釉质龋修复。但目前尚未见临床修复效果图及后续临床应用报道。

（三）无机仿生修复材料

继实验室使用物理化学方法合成HA有序分层结构之后^［11］，有学者受珍珠有序层级结构的启发，合成具有砖瓦混凝土结构的生物陶瓷材料^［12］，其具有较强的强度、硬度和韧性，为体外制造类似牙釉质的仿生修复材料提供了思路。

牙釉质和骨等生物矿化组织具有交错组装结构，其类似于胶合板，且为适应生物体的力学要求和其他功能要求，牙釉质和骨组织需要具有各向异性的特点，有学者用周期性磁场调节无机金属颗粒（氧化铁纳米颗粒或氧化铝显微块）排列取向的模式，制备在组成和质地上具有各向异性特点且有高无机相含量（可高达100%）的强化复合体材料^［13］，类似方法有望用于类牙釉质复合修复材料的制造，使不同部位具有不同的组成和质地，以满足精准的形态及功能修复需求。结合再矿化修复膏技术，或许可实现牙齿硬组织大块缺损的原位仿生修复。

将钇稳定的正方体型氧化锆晶体支架掺入口腔树脂材料，可制备具有珍珠层状结构及砖瓦混凝土结构的聚合物复合材料^［14］，其与牙本质和牙釉质的硬度、刚性和强度接近，并具有较好的韧性，优于现有的口腔修复材料，具有广阔的应用前景。

硅藻、海绵和放射虫等生物体具有硅质层级有序骨架结构，虽然轻巧多孔，却有较高的强度^［15］，对仿生矿化修复材料的合成具有启发意义，学者还可据此合成具有有序层级结构的中空陶瓷支架仿生材料，作为砖瓦混凝土结构生物陶瓷材料的微观砖瓦架构材料^［12］。

二、有机物引导或调控的仿生矿化方法

有机物在仿生矿化中具有重要作用^［16］，利用有机基质诱导矿化过程^［17］，也可直接用生物有机分子做基底促进仿生材料的形成^［18］。该方法中应用如下有机物。

（一）天然有机物/生物聚合物

促进HA矿化生长的天然有机物或生物聚合物主要为蛋白类、多糖类和其他生物高分子，其优势是具备较好的生物相容性和可降解性^［19］。

1.蛋白类物质

（1）蛋白质：釉原蛋白是牙釉质形成过程中的重要功能蛋白，其是一种高度保守的内在无序化结构蛋白^［20］，可促进针状氟磷灰石晶体的定向沉积，有剂量效应^［21］；可调控钙磷结晶的沉积、晶体大小及生长方向^［22］。而釉原蛋白-壳聚糖水凝胶体系可直接在牙釉质表面形成线性排列的纳米HA晶体^［23］，为牙釉质脱矿后的原位仿生矿化修复开创了思路。目前，釉原蛋白在牙釉质仿生矿化中的作用已经明确^［24］，相关研究也日益深入^{［25, 26, 27］}。但釉原蛋白难以纯化，异种来源的釉原蛋白价格昂贵，并可引发过敏反应。

釉基质衍生物来源于釉基质蛋白提取物^［28］，常被用于牙周组织缺损和牙龈等软组织退缩的治疗，已有研究显示，釉基质衍生物可进一步提高现有仿生矿化体系对脱矿牙釉质的再矿化效果。

也有个别研究显示牙本质基质、鲍鱼水溶性基质以及冻干辣木叶提取物等蛋白质具备促进牙釉质再矿化或缺损修复的作用^{［29, 30, 31］}。

（2）多肽：基于釉原蛋白相关功能序列的衍生多肽，可能比釉原蛋白更适合于临床应用。已有研究显示该衍生多肽可促进脱矿牙釉质仿生再矿化^［32］，相关功能主要取决于其特定的功能区域^［33］。

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）来源于牛奶^［34］，是参与牙釉质矿化的蛋白相似物，含有磷酸化的丝氨酸残基，可通过形成无定形纳米复合颗粒稳定钙、磷离子，用于制作促进牙釉质表面再矿化的材料。

自组装双亲肽分子是含疏水性尾端基团连接带电多肽序列的超分子结构，同时含有生物活性基团和专门为矿化过程设计的化学基团^［35］，在特定环境因素刺激下，可自发组装成三维纤维状支架，用于牙釉质仿生矿化领域。合成P₁₁-4多肽是具有双亲性的β-折叠肽^［36］，其可促进新的致密HA晶体成核及晶体形成，还可促进酸蚀后牙釉质的再矿化^［37］，与氟化物及CPP-氟化ACP产品合并使用可发挥协同作用^［37］，其促进牙釉质再矿化的作用优于氟化物和CPP-氟化ACP^［38］。小样本量随机对照临床试验证实，P₁₁-4多肽比氟保护漆促进再矿化的效果更好^［39］。含仿釉原蛋白引导牙釉质矿化功能基团的自组装双亲性寡肽可在钙、磷溶液中诱导ACP晶体形成，并在脱矿牙釉质表面促进再矿化的发生并增强脱矿牙釉质的表面硬度^［40］。也有其他自组装多肽可促进牙釉质再矿化的研究报道^［41］。

根据牙本质磷蛋白促进磷灰石沉积矿化的特征和功能序列，有研究团队设计含谷丙氨酸-丝氨酸-丝氨酸（DSS或NSS）重复序列的小分子多肽，用于牙釉质再矿化研究^［42］，体外实验显示，含有8个重复序列的8-DSS与2倍离子浓度的模拟体液结合使用，以及3-NSS与人工唾液结合使用均可有效促进脱矿牙釉质表面再矿化，但再矿化形成的磷灰石晶体化学组成及微观结构与天然牙釉质明显不同。

类弹性蛋白重组物也称类弹性蛋白多肽^［43］，具有调控晶体成核和生长的作用，且分子内部序列的多变性使其在结构上可被灵活多样调节。近期实验证实，类弹性蛋白重组物可用于诱导釉质样晶体生长并用于修复材料的制备^［44］。

（3）氨基酸：氨基酸原材料简单易得，具有更好的临床转化与应用潜力。谷氨酸可诱导釉柱样结构排列的HA晶体生长^［45］。天冬氨酸或谷氨酸可在脱矿牙釉质表面诱导生长碳酸钙层，进而促进具有釉质样结构的HA结晶生长^［46］。甘氨酸可引导HA-ACP核-壳结构纳米颗粒在脱矿牙釉质表面有序排列并形成ACP，继而无定形结构转化为高度有序的釉柱样HA晶体，达到牙釉质晶体定向、有序仿生再矿化的效果^［47］，但纳米颗粒的构建过程复杂，而且得到的釉质样结构与天然牙釉质结构不完全相同，是否适用临床尚待深入探讨。HA与芳香族氨基酸的结合可影响牙釉质颜色^［48］，由此可影响仿生矿化的美学效果。

（4）胶原：在形成天然牙釉质的早期阶段，釉基质形成胶体环境^［49］，胶体环境与水溶液环境生长的矿物晶体不同。明胶是胶原部分水解的产物，利用明胶凝胶建立的矿化体系模仿生物胶体环境，可成功地直接在牙釉质上形成线性排列的纳米HA晶体^［50］。该矿化体系升级后形成4个层次的矿化系统（牙块底物、磷酸凝胶、保护遮盖层和钙溶液）^［51］，实现均质氟磷灰石层垂直于牙釉质块界面生长，氟磷灰石晶体在每个沉积层成束排列，类似釉柱结构，这是牙釉质仿生矿化修复研究的重要突破，但矿化速率约为500 nm/天，难以有效满足临床应用需要，而且体系中各种物质在临床应用中的生物安全性也需慎重考虑。

2.多糖类生物聚合物：主要有甲壳素、壳聚糖和琼脂材料，这些物质通常作为再矿化的物质载体或可溶性基质材料发挥再矿化作用。

甲壳素为N-乙酰氨基葡萄糖，其脱乙酰基衍生物即氨基葡萄糖为壳聚糖，具备类似纤维素的特性，可协助诱导晶体生长和有序矿物膜形成^{［52, 53］}，参与牙釉质的仿生矿化^［23］。羧甲基壳聚糖可稳定ACP^［47］，磷酸化的壳聚糖与ACP结合形成纳米复合材料促进釉质人工龋再矿化的效果与氟离子作用相当，且速度更快^［54］。经壳聚糖基质转化的β-甲壳素基质还可用以合成具有类似天然珍珠有序层级结构的材料^［55］。

氯化钙琼脂凝胶结合磷酸溶液的琼脂水凝胶仿生矿化体系具有分层结构^［56］，可促进牙釉质或牙本质表面形成高度类似天然牙釉质釉柱结构的HA仿生矿化层^［57］，促进离体磨牙釉质人工龋再矿化^［58］，结合应用釉基质衍生物可进一步提高再矿化效果^［59］。该体系是牙釉质凝胶仿生矿化体系的进一步完善。

3.其他生物高分子：DNA分子结构具有高度复杂性和多变性^［60］，能通过自组装形成不同液晶相，可用于生物矿化^{［61, 62］}。DNA自组装引导矿化对具有预设形态的牙釉质仿生修复材料的合成具有应用优势。

（二）有机化合物及合成聚合物

有机化合物及合成聚合物既可提供有关作用基团或反应位点，也可作为支架结构或矿化模板，还可吸附容纳溶剂以制备水凝胶形态，从而发挥诱导晶体成核、引导晶体定向生长、促进或抑制晶体生长等作用，使得合成聚合物结构可控，这些优势更能满足仿生矿化的特定需求^［19］。牙釉质仿生矿化中应用到如下有机化合物或合成聚合物。

1.三乙胺：主要用于稳定和运输矿物成分。可将含磷酸的乙醇溶液与含氯化钙和三乙胺的乙醇溶液混合，制备三乙胺稳定的磷酸钙离子簇，用于牙釉质原位仿生矿化^［63］。三乙胺随乙醇挥发后，磷酸钙离子簇在牙釉质表面沉积矿化，首先在脱矿的牙釉质HA表面形成一层ACP，通过晶体-无定形相变，诱导HA晶体按牙釉质HA原有结构和方向外延生长，实现牙釉质的同质修复。矿化组织与被修复的牙釉质结构与取向一致，这也是牙釉质仿生矿化修复的突破。但三乙胺的毒性、刺激性，特别是强烈的氨臭气味是临床应用不得不考虑的重要问题。

2.N-（2-羟乙基）乙二胺-N，N′，N′-三乙酸［N-（2-hydroxyethyl）ethylene-diamine-N，N′，N′-triacetic acid，HEDTA］：HEDTA在接近生理条件下（37 ℃，pH=6.0）可诱导矿物离子溶液在脱矿牙釉质表面形成氟化HA^［64］，新形成的矿化层可见直径为2~4 μm的釉柱样结构平行排列，内含直径300~400 nm的HA晶体，强度与天然牙釉质晶体类似；而且矿化过程迅速，1 d后釉柱样结构特征明显，4 d后与天然牙釉质类似。但HEDTA不可食用，需要研发避免该物质与口腔组织接触的装置或技术才能完成临床转化。

3.聚酰胺-胺［poly（amido amine），PAMAM］树状大分子：PAMAM树状大分子在脱矿牙釉质处可作为矿化结晶模板，诱导与天然牙釉质晶体的结构、方向和晶相类似的HA晶体生长^［65］。羧基化PAMAM、用磷酸基团替代羧基基团的PAMAM-PO₄H₂和最新的改良应用均显示出较好的釉质矿化能力^{［66, 67, 68］}。深入探讨不同功能基团（羧基化、磷酸化等）对PAMAM树状大分子再矿化效果（包括结晶成核中心、晶体的取向生长、HA纳米晶体有序排列的调控）的影响，可促进对新的牙釉质再矿化材料的研发。

4.聚丙烯酸：聚丙烯酸结合生物活性玻璃可稳定生物活性玻璃释放的钙、磷离子，形成ACP纳米颗粒前驱体，从而协助脱矿牙釉质的再矿化^［69］。聚丙烯酸也可与结合锌及磷酸盐的HA协同用于釉质人工龋的抗菌及修复处理^［70］。

值得注意的是，无论是天然有机物，还是有机化合物或合成聚合物，其介导的矿化策略均难以形成可调控三维空间结构的矿化产物，为此，有学者将对有机基质表面形貌特征的控制引入矿化体系^［71］，实现了通过控制单个纳米晶体排列进而调控矿化产物微观和宏观尺度结构的目的，展示出选择性调控矿化组织规律层级生长的可能性，这样的调控是对规律层级结构各向异性生长特点的调控，对合成用于修复或再生人体硬组织（包括牙釉质）的仿生矿化材料具有重要启发意义。

三、细胞参与的牙釉质仿生再生

细胞参与牙釉质仿生再生，可总结为直接再生途径和全牙再生途径。

1.直接再生途径：直接再生途径指基于成釉细胞直接实现牙釉质再生，关键在于诱导获得成熟稳定的成釉细胞。目前已建立的5个主要的成釉细胞诱导培养体系还在尝试和完善阶段^［72］，在一定程度上可实现釉质样结构的形成，但距离釉质组织再生尚有不小差距。成釉细胞的诱导来源于干细胞或前体细胞的定向分化，可应用非牙源性上皮来源人体细胞或干细胞，例如牙龈上皮细胞、诱导多能干细胞、人角质细胞干细胞等^［73］；也可直接选择牙源性上皮细胞或干细胞，例如上皮剩余、缩余釉上皮和牙板或其残余来源的细胞^［73］。根尖乳头干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周韧带干细胞等牙源性干细胞在牙本质、牙髓和牙周组织再生中的研究较多^［74］，但尚未见牙釉质再生相关研究。有学者应用牙源性上皮干细胞建立上皮与间充质相互作用的新型细胞培养模型^［75］，用于成釉细胞的稳定诱导，可为基于细胞的牙釉质再生带来有益的启示。

2.全牙再生途径：全牙再生途径是指通过诱导牙胚形成或牙齿发育实现牙齿再生，其中包含牙釉质结构再生。该途径可从原始的基因和信号通路机制入手，结合细胞、仿生骨架、信号分子及牙源性间充质等成分组成的复合体系^［73］，构建牙蕾或诱导牙胚结构的形成^{［76, 77］}，但成效依然依赖于对相关作用机制细节理解的完善^{［78, 79］}，目前对该途径的了解仍在起步阶段。全牙再生途径也可直接通过牙胚移植或成釉器移植实现^{［73，80］}；还可利用多生牙发生机制^［81］，研制靶向分子治疗药物，直接原位诱导牙齿再生（包括正常牙釉质的形成），可能成为实现全牙再生的捷径。

综上，牙釉质脱矿的无机再矿化研究已较成熟，目前有多种产品可获得一定的临床效果；仿生修复材料的研发可得到更接近牙釉质微观结构与性能的陶瓷或复合体修复材料，为牙釉质缺损修复带来更好的效果，相关进展值得期待；有机分子原位诱导HA晶体仿生修复生长的方法是研究热点，也取得了一些突破性成果，但通过仿生矿化手段构建具有规律层级结构特性的类牙釉质结构仍是需要努力的方向，仿生再矿化的组织量也是需要突破的方面；基于细胞的再生体系因为机制复杂且影响因素众多，相关探究仍处在相对初级的阶段，但潜在优势明显，是未来实现牙釉质仿生再生的一个重要方向。

目前在牙釉质仿生矿化修复研究方面，距离实现从纳米、微观和宏观尺度均具有釉质独特有序层级结构的足量的牙齿硬组织修复，尚存差距。作者对牙釉质仿生修复研究的未来展望及建议如下：①深入探讨不同物质种类（氟化物、无机离子、蛋白质、甲壳素、高分子、有机小分子等）如何有效控制HA晶体成核、取向生长、有序排列等，是未来牙釉质仿生修复及产品研发的重要理论基础。②如何快速、高效、多量地实现原位仿生矿化并实现临床转化应用是需要进一步努力的方向。③充分开发蛋白、多糖和DNA等带手性基团分子的自组装应用以引导矿物质的规律有序沉积^［82］。④牙釉质仿生矿化的进步需要多学科（化学、材料、物理、工学、医学等）交叉的协同研发和转化^［19］，模拟细胞结构及功能制造纳米机器细胞，研发纳米机器人仿生矿化体系也是一个有意义的方向。