口腔种植修复已成为牙齿缺失患者的首选治疗方案。目前，临床常用种植修复基台材料为纯钛及钛合金，但对于薄龈生物型患者，基台金属颜色可透过覆盖的黏膜组织，影响种植修复美学效果^［1］。即使是厚龈生物型患者，种植体周围软组织的不稳定性随时间的推移也可导致金属基台或种植体暴露^［2］。近年，多种新型材料被引入种植修复领域，聚醚醚酮由于弹性模量近似骨皮质^［3］，且具有较大的可调改空间，颜色接近牙体组织，在口腔领域引起广泛关注^［4］。目前，关于聚醚醚酮在口腔美学区软组织附着的相关研究较少。口腔软组织附着主要包括结缔组织附着和上皮附着，上皮主要通过半桥粒和基底板附着于种植修复体表面^［5］。本项研究初步探究不同修复基台材料对牙龈上皮细胞半桥粒黏附相关基因及蛋白表达的影响，以期筛选出更易于上皮附着的基台材料。

本项研究时间范围为2021年12月至2022年9月。

1.实验材料和设备：

（1）主要实验材料：纯钛、聚醚醚酮、氧化锆（深圳爱尔创科技有限公司）；4%多聚甲醛（Servicebio，武汉）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（Dojindo，日本）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（Biological Industries，以色列）；反转录试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司）；荧光定量PCR试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司）。

（2）主要实验设备：扫描电镜（EVO18，Zeiss，德国）；白光干涉仪（Wyko NT9300，Veeco Instruments Inc.，美国）；光学接触角测量仪（KSV CAM101，芬兰）；研究级倒置显微镜（奥林巴斯，日本）；全自动酶标仪（Infinite200，Tecan，瑞士）；分光光度计（Nanodrop，Thermo Fisher Scientific，美国）；PCR仪（T-Gradient biometra，耶拿，德国）；实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（LightCycler 96，Roche，美国）。

2.不同基台材料表面特征检测：

（1）试件准备：将聚醚醚酮、氧化锆和纯钛制备成直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件各36个和直径33.9 mm、厚度1.5 mm的试件各12个，400、600、800、1 000、1 200、2 000、3 000目碳化硅砂纸逐级打磨抛光，再用抛光膏细抛。依次用无水乙醇、去离子水、超纯水分别超声清洗试件3次，20 min/次，去除表面污垢，干燥后，高温高压消毒备用。

（2）表面形貌观察：用随机数表法从每组随机选取3个直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件，固定、喷金后扫描电镜观察各组试件表面形貌。

（3）表面粗糙度测量：用随机数表法从每组随机选取3个直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件，用白光干涉仪获得试件表面三维重建图像，测量平均粗糙度（Ra值）和平均最大高度（Rz值），并计算均值。

（4）接触角检测：用随机数表法从每组随机选取3个直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件，用光学接触角测量仪通过静态接触角测量方式测量接触角。

3.不同基台材料表面人牙龈上皮细胞的黏附：人牙龈上皮细胞购置于济南楚汉生物技术有限公司（源自人口腔黏膜组织，经过永生化处理的人正常口腔上皮角质永生细胞株）。

（1）材料表面细胞早期黏附形态观察：用随机数表法从每组随机选取3个直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件，分别置于48孔板中，将1.0×10⁴ 个/ml的细胞悬液接种于材料表面培养，培养箱中孵育24 h停止培养。PBS冲洗，4%多聚甲醛中固定4 h，PBS冲洗2次，5 min/次，乙醇梯度脱水后，干燥，扫描电镜观察各组试件表面的细胞形态。

（2）材料表面细胞增殖能力检测：用随机数表法从每组随机选取24个直径8.5 mm、厚度1.5 mm的试件，每组每个时间点设6个平行试件，且每个时间点设置空白对照孔。将试件分别置于48孔板中，将1.0×10⁴ 个/ml的细胞悬液接种于材料表面培养，培养1、3、5、7 d终止培养，去除原培养基及未贴壁细胞，PBS冲洗3次。制备所需CCK-8工作液（每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液），将CCK-8工作溶液接种于试件表面，置于培养箱中孵育2 h。吸取100 μl/孔培养基混合液至96孔板，全自动酶标仪450 nm波长下检测吸光度值（A值）。

4.不同基台材料表面牙龈上皮细胞半桥粒黏附基因的表达水平：用随机数表法从每组随机选取6个直径33.9 mm、厚度1.5 mm的试件置于6孔板，将2.0×10⁵ 个/ml的细胞悬液接种于试件表面，培养3和7 d（每组每个时间点样本量为3）后终止培养，PBS冲洗2次，加入Trizol裂解细胞，收集、提取细胞总RNA，测定RNA浓度，反转录为cDNA，RT-qPCR检测黏附相关基因的表达。所用引物委托苏州金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

5.不同基台材料表面牙龈上皮细胞半桥粒相关蛋白的表达水平：用随机数表法从每组随机选取6个直径33.9 mm、厚度1.5 mm的试件置于6孔板，将2.0×10⁵ 个/ml细胞悬液接种于试件表面，培养3和7 d（每组每个时间点样本量为3）后终止培养，提取试件表面蛋白，检测蛋白浓度、蛋白变性，再进行配胶、电泳、转膜、封闭、孵抗体、图像采集。

6.统计学方法：使用SPSS 26.0软件，使用S-W检验和Levene检验证实所有数据符合正态分布且方差齐，用“x?±s”形式表达，采用单因素方差分析进行总体比较，两两比较采用LSD法。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

1.各组材料表面特征的比较：见图1，表2。

（1）表面形貌：各组试件经抛光后，均呈平坦、光滑的表面形貌，但试件表面仍可见部分沟槽状的机械打磨痕迹和部分散在点状杂质，聚醚醚酮组表面沟槽状打磨痕迹比其他两组略多（图1）。

（2）表面粗糙度：聚醚醚酮组和氧化锆组表面光学图像均为中性的绿色，即试件表面较平整，聚醚醚酮组试件表面高峰略多；纯钛组表面光学图像绿色和蓝色交替出现，形成如山峰和山谷的形态（图1）。氧化锆组Ra值和Rz值均为最小，纯钛组Ra值和Rz值均为最大，组间差异均有统计学意义（P<0.05）（表2）。

（3）表面接触角：3组试件表面接触角差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.各组人牙龈上皮细胞黏附和增殖：见图2。

（1）细胞黏附：3组均可见大量细胞贴附生长，呈较好的铺展状态，细胞呈扁平伸展的多边形、多角形等不规则形状，为典型的铺路石样（图2）。

（2）细胞增殖：见表3。3组A值随培养时间增加逐渐增大。培养1和3 d时3组总体差异均无统计学意义（P>0.05）；培养5和7 d时聚醚醚酮组A值均显著大于同时间点氧化锆组和纯钛组（P<0.05），纯钛组A值均显著大于同时间点氧化锆组（P<0.05）。

3.各组人牙龈上皮细胞半桥粒黏附相关基因表达水平的比较：见表4。3组半桥粒黏附相关基因的表达量均随培养时间的增加而增加。培养3和7 d，聚醚醚酮组层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17的mRNA表达水平均显著大于同时间点氧化锆组和纯钛组（P<0.05）；氧化锆组各时间点层粘连蛋白α3、整合素β4的mRNA表达水平均显著大于同时间点纯钛组（P<0.05），各时间点胶原蛋白17的mRNA表达水平均显著小于同时间点纯钛组（P<0.05）。

4.各组人牙龈上皮细胞半桥粒黏附相关蛋白表达水平的比较：见图3，表5。培养3和7 d，聚醚醚酮组层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17的蛋白表达量均显著大于氧化锆组和纯钛组（P<0.05）；培养7 d纯钛组层粘连蛋白α3和胶原蛋白17的蛋白表达量显著小于氧化锆组（P<0.05），其余时间点纯钛组和氧化锆组层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17的蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。

注：GAPDH为甘油醛?3?磷酸脱氢酶

种植基台与周围软组织形成良好的软组织封闭可在口腔环境和牙槽骨之间发挥保护作用，防止食物残渣、口腔内细菌以及其他致炎因子定植侵入种植体，进而防止不可逆的边缘骨丢失^［6］。因此，种植体颈部周围软组织与基台之间良好的生物学封闭，对种植体的长期稳定至关重要^{［7, 8］}。

对不同种植基台材料表面特征的研究主要包括表面形貌、表面粗糙度和亲水性，其对软组织细胞的生物学行为有显著影响^［9］。本项研究扫描电镜观察显示，3组试件均呈平坦、光滑的表面形貌，但仍可见部分机械打磨痕迹，呈沟槽状和部分散在点状杂质，表面沟槽状打磨痕迹聚醚醚酮组比氧化锆和纯钛组略多，推测可能由于聚醚醚酮组的弹性模量较低^［3］，更易受外力的影响。本项研究分析表面粗糙度的2项指标：Ra值和Rz值。Ra值是评价材料表面粗糙度的常用参数^［10］，指材料表面轮廓各点至轮廓中线距离绝对值的平均值，Rz值指材料表面轮廓峰顶线和轮廓谷底线之间的平均距离，Ra值和Rz值的数值越小，代表材料表面越光滑。结果显示，氧化锆组Ra值和Rz值均显著小于其他两组，提示氧化锆表面最光滑。但已有研究显示，当Ra值<500 nm时均可定义为光滑级，适用于光滑基台材料表面的研究^［11］。本项研究3组材料Ra值均<500 nm，均属于光滑级材料，可进行细胞生物学研究。

基台表面亲水性是影响细胞在修复基台表面生物相容性的重要因素，表面接触角是评价材料表面是否具有亲水性的重要指标。本项研究结果显示，3组材料表面接触角均<90°，即均具有良好的亲水性。已有研究显示，具有亲水性的材料有助于细胞的早期增殖、黏附以及蛋白质吸附^{［12, 13］}。

目前，口腔软组织生物学封闭是种植研究的前沿领域之一。较多研究将人牙龈上皮细胞作为软组织与种植基台附着相关的重要细胞^［14］。已有研究显示，种植体周围屏障上皮是种植体周围软组织生物学封闭的关键，其与结合上皮相似，可通过半桥粒和基底板附着于基台表面^［5］。半桥粒是上皮细胞特有的附着结构，在种植体周围上皮封闭的细胞黏附过程中，上皮细胞通过半桥粒和基底板结构黏附于基台表面^［15］。半桥粒结构主要由跨膜蛋白（整合素α6β4、胶原蛋白17、CD151）、基质蛋白（层粘连蛋白-5）、细胞质蛋白（plectin，BP230）和中间纤维（keratin-5和keratin-14）组成^［16］。本项研究主要分析主要黏附分子——层粘连蛋白α3、整合素β4和胶原蛋白17的基因和蛋白表达情况。层粘连蛋白-5是由3个亚基（层粘连蛋白α3、β3和γ2）组成的糖蛋白复合体，是基底膜的重要组成部分，可诱导半桥粒形成，影响细胞的黏附和分化，并与整合素β4（作为层粘连蛋白的受体发挥作用）结合^［17］，通过半桥粒参与细胞黏附。层粘连蛋白-5 α3链的球状结构域（G结构域）在半桥粒组装的成核和维持半桥粒结构完整性方面均发挥重要作用。胶原蛋白17是半桥粒结构的一种跨膜蛋白，可促进细胞黏附和迁移，其通过整合素β4与细胞结合，为细胞的黏附及迁移提供轨迹和信号传导，层粘连蛋白α3、整合素β4和胶原蛋白17 均对龈牙结合部的发育和维持至关重要。

本项研究将聚醚醚酮、氧化锆及纯钛材料与人牙龈上皮细胞共培养，评价细胞的黏附和增殖能力。结果显示，人牙龈上皮细胞在3组材料表面均显示良好的早期黏附状态，3组无明显差别。细胞培养5和7 d聚醚醚酮组细胞增殖能力（A值）显著大于氧化锆组和纯钛组。因此推测，聚醚醚酮组材料表面更有利于人牙龈上皮细胞的增殖，聚醚醚酮作为一种具有优良理化特性的生物医学高分子材料，在口腔领域有良好的应用前景^［4］。本项研究进一步通过RT-qPCR和蛋白质印迹法检测3组材料表面人牙龈上皮细胞半桥粒黏附基因和蛋白表达水平。结果显示，层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17基因和蛋白的表达水平均随时间增加而增加，相较氧化锆组和纯钛组，聚醚醚酮组层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17的mRNA和蛋白表达水平显著增高；证实聚醚醚酮更有利于促进牙龈上皮细胞半桥粒层粘连蛋白α3、整合素β4、胶原蛋白17 基因和蛋白的表达，进而调控半桥粒的连接，有利于口腔软组织细胞半桥粒的黏附。

综上，3组材料均具有良好的细胞初期黏附状态，聚醚醚酮材料相较氧化锆和纯钛更有利于人牙龈上皮细胞半桥粒的黏附。因此，可认为聚醚醚酮是一种有前景的基台材料，具有较高的临床应用价值，但若将聚醚醚酮材料作为种植修复基台材料应用于临床，其综合性能尚待进一步探究。