糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病较为严重的常见并发症之一[1]。糖尿病肾损害与肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)密切相关,表现为肾组织内血管紧张素水平升高以及高水平血管紧张素II所致肾足细胞凋亡[2,3,4]。维生素D不仅调节钙磷代谢,同时还具有负调节RAS系统并抑制肾素合成的作用,但2型糖尿病患者存在维生素D缺乏或不足[5,6,7]。
几乎所有人有核细胞均表达维生素D受体(vitamin D receptor,VDR),维生素D需与VDR结合后才能发挥其生物学活性[8]。人VDR基因位于12号染色体长臂,其序列中有BsmI、ApaI、FokI、TaqI等多个限制性核酸内切酶位点,近年发现BsmI和TaqI位点相关基因多态性或基因型与2型糖尿病易感性密切相关[9,10,11,12],但VDR基因多态性与DKD关系研究甚少且未有定论。本研究拟探讨血清25-羟基维生素D水平、VDR基因多态性与2型糖尿病肾病易感性的关系,以期进一步了解基因水平上DKD的发病机制。
2014年4~12月浙江中医药大学附属第一医院178例2型糖尿病住院患者,其中男性92例,女性86例,年龄范围53~81岁。病例排除标准:(1)非汉族;(2)病例之间有血缘关系;(3)1型糖尿病及各类继发性糖尿病;(4)慢性肾炎、原发性肾小球肾炎、尿路感染、输尿管结石和肿瘤;(5)痛风;(6)系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜;(7)更年期女性;(8)合并心血管、肝、肾等严重疾病;(9)应激反应导致的尿蛋白增高等。另选择48名健康体检者作为对照组(NC组),其中男性27名,女性21名,年龄范围55~80岁,对照组经口服葡萄糖耐量试验(OGTT)排除糖尿病,同时排除心血管、肝、肾等疾病。
采用1999年世界卫生组织公布的2型糖尿病诊断标准诊断2型糖尿病:(1)有糖尿病症状,随机血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dl);(2)空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L(126 mg/dl);(3)餐后2 h血糖(2hPG)≥11.1 mmol/L(200 mg/dl)[13]。根据2007年美国肾脏病基金会及Pedersen等介绍的DKD诊断指南和分期标准,将上述患者分为糖尿病非肾病组(DM1组89例,尿白蛋白<30 mg/24 h)、糖尿病微量白蛋白尿组(DM2组69例,尿白蛋白30~299 mg/24 h)、糖尿病大量白蛋白尿组(DM3组20例,尿白蛋白≥300 mg/24 h)[14,15]。非糖尿病性肾病(non-DKD)排除标准:(1)病程较短或未合并糖尿病视网膜病变;(2)肾小球滤过率(GFR)较低或下降过快;(3)尿蛋白迅速增加或出现肾病综合征;(4)顽固性高血压;(5)出现活动性尿沉渣;(6)其他系统性疾病的症状或体征;(7)给予血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂治疗后2~3个月内GFR下降大于30%;(8)肾脏超声发现异常[14]。
测量糖尿病患者身高、体重、体重指数(BMI),Cobas全自动生化分析仪测定FPG、血脂和肝肾功能指标,高效液相色谱法检测HbAlC。采用电化学发光法在Cobase 411罗氏全自动电化学发光免疫分析仪上测定血清25-羟基维生素D,检测试剂盒和质控品均购自Roche Diagnostics GmbH公司,批内CV≤7.8%,批间CV≤10.7%。留取糖尿病患者早上8∶00至次日早上8∶00间尿液,测量尿液体积,采用免疫比浊法在雅培C16000全自动生化分析仪上检测白蛋白浓度并计算24 h尿白蛋白含量,白蛋白测定试剂盒和复合蛋白质控液均购自Orion Diagnostica Oy公司,批内CV≤5.3%,批间CV≤13.8%。
(1)细胞基因组DNA提取:采集受试者EDTA抗凝血2 ml,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)。采用异丙醇沉淀法提取PBMC基因组DNA,分光光度法测定其浓度和纯度。(2)PCR:采用文献报道的VDR基因rs731236、rs11568820、rs1544410、rs7975232位点扩增引物,委托上海星耀医学科技发展有限公司合成各引物(表1)[12,16,17]。采用高保真PCR试剂盒(TaKaRa)扩增不同位点VDR基因片段。采用20 μl反应体系,其中引物0.2 μmol/L、DNA模板100 ng。PCR反应条件:95℃ 2 min;94℃ 30 s、57℃ 90 s、72℃ 60 s,35个循环;72℃ 10 min。采用溴化乙锭预染色的3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(表1)。
表1 Tab 1 |
位点Site | 引物序列(5′-3′) Primer sequence(5′-3′) | 产物Product (bp) |
---|---|---|
rs11568820 | F:CATTGTAGAACATCTTTTGTATCAGGA | 151 |
R:TGTAGCAATGAAAGCAAACCA | ||
rs731236 | F:GAAGTCACTGGAGGGCTTTG | 384 |
R:CACTCAGGCTGGAAGGAGAG | ||
rs1544410 | F:GTGTGCAGGCGATTCGTA | 300 |
R:GGTCACAATAACTTCCTCTTCG | ||
rs7975232 | F:GAAGTCACTGGAGGGCTTTG | 384 |
R:CACTCAGGCTGGAAGGAGAG | ||
注:VDR:维生素D受体Vitamin D receptor; F:上游Forward;R:下游Reverse
LDR上下游探针由上海星耀医学科技发展有限公司设计并合成,其中上游探针5′端磷酸化修饰(表2),然后配制浓度为12.5 pmol/μl各探针混合液。LDR反应体系10 μl:探针混合液1 μl、连接酶0.05 μl、PCR产物1 μl、缓冲液1 μl。LDR反应条件:95℃ 2 min;94℃ 15 s,50℃ 25 s,30个循环。采用紫外分光光度仪测定LDR反应产物浓度后委托上海星耀医学科技发展有限公司测序并进行片段分析,获得的数据用Genemapper软件进行分析。
表2 Tab 2 |
位点Site | 探针Probe | 探针序列(5′-3′) Probe sequence(5′-3′) | 产物Product (bp) |
---|---|---|---|
rs11568820 | rs11568820 | P-TGTGACCTAGTTTACTCAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM | |
rs11568820_A | TTTTTTTTTTTTTTTTCATAATAAGAAATAAGTTTTTAT | 77 | |
rs11568820_G | TTTTTTTTTTTTTTTTTTCATAATAAGAAATAAGTTTTTAC | 79 | |
rs731236 | rs731236 | P-ATCAGCGCGGCGTCCTGCACCCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM | |
rs731236_C | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGCGGTCCTGGATGGCATCG | 150 | |
rs731236_T | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGCGGTCCTGGATGGCATCA | 152 | |
rs1544410 | rs1544410 | P-GCAGGCCTGTCTGTGGCCCCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM | |
rs1544410_A | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATGT | 155 | |
rs1544410_G | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATGC | 157 | |
rs7975232 | rs7975232 | P-CCTCACTGCTCAATCCCACCACCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM | |
rs7975232_C | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGGCACAGGAGCTCTCAGCTGaGCC | 160 | |
rs7975232_A | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGGCACAGGAGCTCTCAGCTGaGCA | 162 |
注:VDR:维生素D受体Vitamin D receptor; LDR:连接酶检测反应Ligase detection reaction
符合正态分布的计量资料以±s表示,计数资料与频数以百分比表示。采用SPSS 17.0软件分析获得的数据:计算样本基因型频率并进行Hardy-Weinberg平衡检验,计量资料之间比较使用t检验和方差分析,计数资料之间比较使用χ2检验并多重比较。采用SHEsis软件分析VDR基因各位点连锁不平衡性,r2>0.33判为连锁不平衡。
178例2型糖尿病患者中,DM1、DM2、DM3分别为89、69和20例。各组年龄、性别、BMI无显著差异,DM1、DM2和DM3组之间HbA1C也无显著差异,但DM3组病程显著较DM1和DM2组长,DM1、DM2和DM3组收缩压、FPG和TG均明显高于NC(P<0.05,表3),DM2和DM3组尿白蛋白水平与血肌酐和尿素氮水平相符,与DKD病程进展一致。
表3 Tab 3 |
组别Group | 例数n | 年龄(岁) Age (year) | 男性/女性Male/Female | BMI (kg/m2) | 病程(年) Duration (year) | SBP (mmHg) | DBP (mmHg) |
---|---|---|---|---|---|---|---|
NC | 48 | 58.9±9.5 | 27/21 | 23.0±3.2 | - | 117±17 | 78±9 |
DM1 | 89 | 58.1±11.0 | 49/40 | 23.9±3.1 | 7.2±3.5 | 132±15a | 80±8 |
DM2 | 69 | 60.5±8.6 | 32/37 | 24.2±2.8 | 8.5±3.1 | 142±14b | 84±10 |
DM3 | 20 | 59.3±10.5 | 11/9 | 24.9±3.3 | 11.9±4.3c | 141±19b | 83±9 |
组别Group | 例数n | HbA1C (%) | TC (mmol/L) | TG (mmol/L) | FPG (mmol/L) | SCr (μmol/L) | BUN (mmol/L) |
---|---|---|---|---|---|---|---|
NC | 48 | - | 4.2±0.9 | 1.6±1.3 | 5.2±1.0 | 67.5±6.1 | 5.3±1.9 |
DM1 | 89 | 8.1±1.9 | 4.6±1.2 | 2.4±0.9a | 9.4±1.2b | 79.0±5.2 | 5.5±1.7 |
DM2 | 69 | 8.5±2.4 | 5.2±1.5 | 2.5±1.3a | 10.8±2.3b | 108.6±12.3bc | 6.0±1.9 |
DM3 | 20 | 7.8±1.6 | 5.4±1.9b | 2.8±1.7b | 10.1±2.8b | 181.6±30.1bd | 9.3±2.0bd |
注:NC:对照组Control group;DM1:糖尿病非肾病组Diabetes mellitus without kidney disease group(UA<30 mg/24 h,UA:尿白蛋白Urinary albumin); DM2:糖尿病微量白蛋白尿组Diabetes mellitus microalbuminuria group(UA 30~299 mg/24 h); DM3:糖尿病大量白蛋白尿组Diabetes mellitus macroalbuminuria group(UA≥300 mg/24 h); BMI:体重指数Body mass index;SBP:收缩压Systolic blood pressure;1 mmHg=0.133 kPa; DBP:舒张压Diastolic blood pressure;TC:总胆固醇Total cholesterol;TG:三酰甘油Triglyceride;FPG:空腹血糖Fasting plasma glucose;SCr:血肌酐Serum creatinine;BUN:血尿素氮Blood urea nitrogen;与NC组比较vs NC group, aP<0.05,bP<0.01;与DM1组比较vs DM1 group, cP<0.05,dP<0.01
DM1、DM2、DM3和NC血清25-羟基维生素D水平分别为(20.28±6.33)、(17.85±8.02)、(14.41±9.18)和(28.60±7.29)ng/ml。DM1、DM2、DM3组患者血清25-羟基维生素D水平均显著低于NC组(P<0.01);随着DKD病情加重,血清25-羟基维生素D水平呈进行性下降趋势,DM3组患者血清25-羟基维生素D水平显著低于DM1组(P<0.05)。
由于DM3组患者仅有20例,故将DM2和DM3组合并后再对4个位点基因多态性分布进行Hardy-Weinberg平衡检验。结果显示,各位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。
VDR基因各位点连锁不平衡性检验结果显示,rs731236与rs1544410位点之间r2=0.959,其余各位点之间r2<0.33,故rs731236与rs1544410位点之间存在显著性连锁不平衡(表4)。
表4 Tab 4 |
位点Site | r2 | |||
---|---|---|---|---|
rs731236 | rs1544410 | rs7975232 | rs11568820 | |
rs731236 | - | 0.959 | 0.151 | 0.006 |
rs1544410 | 0.959 | - | 0.145 | 0.005 |
rs7975232 | 0.151 | 0.145 | - | 0.000 |
rs11568820 | 0.006 | 0.005 | 0.000 | - |
由于DM3组患者仅有20例,故将其与DM2组合并后与NC组进行比较。为排除不同病程对DKD病情的影响,本研究将患者分为≤5年和6~15年2个病程区间进行了比较。结果显示,病程≤5年DKD患者(DM2+DM3)rs1544410位点AG基因型和A等位基因频率、rs731236位点CT基因型和C等位基因频率均显著高于DM1和NC组(P<0.05或P<0.01,表5),尽管病程6~15年DKD患者rs1544410位点AG基因型和rs731236位点CT基因型频率也显著高于DM1和NC组(P<0.05或P<0.01),但可能因样本数较少,A和C等位基因频率仅显著高于NC组(P<0.05,表6)。不同病程DKD患者rs11568820和rs7975232位点基因型和基因频率与DM1和NC组比较均无显著性差异(表5和表6)。
表5 Tab 5 |
组别Group | rs7975232 | rs11568820 | rs1544410 | rs731236 | ||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
基因型Genotype | 基因频率Allele | 基因型Genotype | 基因频率Allele | 基因型Genotype | 基因率Allele | 基因型Genotype | 基因频率Allele | |||||||||||
CC | AC | AA | A | C | AA | AG | GG | A | G | AG | GG | A | G | CT | TT | C | T | |
NC | 29 | 16 | 3 | 22 | 74 | 8 | 23 | 17 | 39 | 57 | 2 | 46 | 2 | 94 | 3 | 45 | 3 | 93 |
DM1 | 15 | 15 | 3 | 21 | 45 | 3 | 23 | 7 | 29 | 37 | 2 | 31 | 2 | 64 | 2 | 31 | 2 | 64 |
DM2+DM3 | 22 | 10 | 2 | 14 | 54 | 7 | 18 | 9 | 32 | 36 | 10ab | 24 | 10ab | 58 | 10ab | 24 | 10ab | 58 |
注:略语同表1和表3 The abbreviations are the same as Tab 1 and Tab 3;与NC组比较vs NC group,aP<0.01;与DM1组比较vs DM1 group,bP<0.05
表6 Tab 6 |
组别Group | rs7975232 | rs11568820 | rs1544410 | rs731236 | ||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
基因型Genotype | 基因频率Allele | 基因型Genotype | 基因频率Allele | 基因型Genotype | 基因频率Allele | 基因型Genotype | 基因频率Allele | |||||||||||
CC | AC | AA | A | C | AA | AG | GG | A | G | AG | GG | A | G | CT | TT | C | T | |
NC | 29 | 16 | 3 | 22 | 74 | 8 | 23 | 17 | 39 | 57 | 2 | 46 | 2 | 94 | 3 | 45 | 3 | 93 |
DM1 | 21 | 17 | 7 | 31 | 59 | 13 | 20 | 12 | 46 | 44 | 5 | 40 | 5 | 85 | 5 | 40 | 5 | 85 |
DM2+DM3 | 25 | 18 | 5 | 28 | 68 | 8 | 26 | 14 | 42 | 54 | 15ab | 33 | 15a | 81 | 15ab | 33 | 15a | 81 |
注:略语同表1和表3 The abbreviations are the same as Tab 1 and Tab 3;与NC组比较vs NC group,aP<0.01;与DM1组比较vs DM1 group,bP<0.05
以血肌酐、血尿素氮、病程、rs1544410基因型、rs731236基因型、血清25-羟基维生素D水平为自变量,DKD为因变量,进行logistic回归分析。结果显示,血肌酐、rs1544410和rs731236基因型与2型糖尿病肾病发生相关(表7)。
表7 Tab 7 |
自变量Variable | B | SE | Wald | df | P | Exp (B) | 95%CI |
---|---|---|---|---|---|---|---|
病程Duration | 0.054 | 0.037 | 2.134 | 1 | 0.144 | 1.055 | 0.982-1.134 |
25-OH-D | -0.016 | 0.032 | 0.243 | 1 | 0.622 | 0.984 | 0.925-1.048 |
rs1544410 | 1.778 | 0.676 | 6.905 | 1 | 0.009 | 5.309 | 1.465-19.245 |
rs731236 | 1.778 | 0.676 | 6.905 | 1 | 0.009 | 5.309 | 1.465-19.245 |
注:25-OH-D:25-羟基维生素D 25-OH vitamin D
DKD为2型糖尿病较为严重的并发症之一,其发病机制与糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、肾血流动力学改变及遗传等多种因素有关[1]。业已证实,RAS系统与DKD发生和发展密切相关[2]。有文献报道,维生素D对RAS系统具有抑制作用,其主要机制之一为抑制肾素合成,从而对高糖诱导的肾损害起保护作用[5,6,7,18]。
本研究比较了DM1、DM2、DM3和NC组血清25-羟基维生素D水平差异,结果显示3组糖尿病患者血清25-羟基维生素D水平均显著低于NC组(P<0.05)、DM3组血清25-羟基维生素D水平明显低于DM1组(P<0.01),提示维生素D水平低下可能与2型糖尿病以及DKD密切相关。早年文献报道,维生素D缺乏可引起胰岛素分泌不足,但补充维生素D后胰岛β细胞功能和葡萄糖耐量均得到改善[19,20,21]。此后研究证明,维生素D可促进胰岛素合成和分泌、增加胰岛素受体敏感性、下调炎性因子和血管紧张素及肾素表达、抑制β细胞凋亡[5,22,23,24,25,26]。此外,国外学者研究发现,DKD患者维生素D缺乏或不足发生率明显高于糖尿病非肾病患者[27]。上述资料表明,维生素D不足或缺乏与DKD相关。
人VDR基因位于12号染色体长臂上,含有多个限制性内切酶位点,其中以BsmI、ApaI、FokI、TaqI酶切位点研究较多,通常用b、a、f、t表示存在这4个酶切位点多态性,B、A、F、T表示缺乏多态性,这些位点多态性常与2型糖尿病易感性相关[9,10,11,12]。国内文献报道,VDR基因FokI位点多态性与2型糖尿病发病及糖耐量受损(IGT)患者胰岛素抵抗相关,BsmI位点b等位基因为2型糖尿病发病的危险因素[28,29,30],但迄今对VDR基因多态性与DKD关系研究甚少且未有定论。国内学者发现VDR基因BsmI位点B等位基因2型糖尿病患者易出现大量白蛋白尿[11],但国外学者发现AGT BsmI/ApaI/TaqI单倍体基因型可保护1型糖尿病患者免于发展成DKD[11,31]。本研究选择的rs731236、rs7975232、rs1544410、rs11568820四个位点,分别为TaqI、ApaI、BsmI酶切位点和转录因子Cdx-2结合位点。Cdx-2与位于VDR基因启动子区Cdx-2结合位点结合后,调节肠上皮细胞VDR基因转录,但Cdx-2结合位点A等位基因结合Cdx-2活性较G等位基因更强,Cdx-2结合位点多态性多见于骨密度和骨代谢研究。
本研究结果显示,糖尿病患者上述4个位点中rs731236与rs1544410位点之间存在显著连锁不平衡,其基因型和基因频率也基本一致,即rs731236位点基因型为杂合子CT时,rs1544410位点基因型也为杂合子AG,表明rs731236和rs1544410之间存在关联性,与国外文献报道一致[11]。进一步分析后发现,病程≤5年糖尿病肾病组(DM2+DM3)rs731236位点CT基因型和C等位基因频率、rs1544410位点AG基因型和A等位基因频率均显著高于DM1组和NC组(P<0.05),病程6~15年糖尿病肾病组(DM2+DM3)rs731236位点CT基因型及rs1544410位点AG基因型频率也显著高于DM1组(P<0.05),logistic回归分析结果也显示rs731236和rs1544410位点基因型与2型糖尿病肾病发生相关,表明VDR基因rs731236位点CT基因型和rs1544410位点AG基因型可能是DKD发病的独立危险因素、VDR基因rs731236位点C等位基因和rs1544410位点A等位基因可能是DKD的易感基因。本研究未发现rs7975232位点(ApaI)和rs11568820位点(Cdx-2结合位点)与DKD有关,与以往的文献报道一致[25]。
综上所述,本研究结果表明维生素D水平低下与糖尿病和DKD具有密切关系,VDR基因rs1544410和rs731236的基因型与DKD的发生具有相关性,rs1544410等位基因A和rs731236等位基因C可能为DKD易感基因。
了解维生素D水平及其受体(VDR)基因多态性与糖尿病肾病发病的相关性。
根据Mogensen等介绍的标准将178例住院2型糖尿病患者分为糖尿病非肾病组、糖尿病微量白蛋白尿组、糖尿病大量白蛋白尿组,另选择48名健康体检者作为正常对照组。采用化学发光法检测上述患者和健康体检者血清25-羟基维生素D水平。采用PCR-LDR检测上述受试者外周血单个核细胞VDR基因rs731236、rs11568820、rs1544410、rs7975232位点的多态性。采用多种统计学软件分析血清25-羟基维生素D水平及VDR基因多态性与糖尿病肾病的相关性。
各组糖尿病患者血清25-羟基维生素D水平均显著低于正常对照组(P<0.01)。糖尿病大量白蛋白尿组患者血清25-羟基维生素D水平显著低于糖尿病非肾病组(P<0.05),但糖尿病微量白蛋白尿组与糖尿病非肾病组患者血清25-羟基维生素D水平无显著差异。糖尿病肾病组患者VDR基因rs1544410位点AG基因型和A等位基因、rs731236位点CT基因型和C等位基因频率显著高于糖尿病非肾病组(P<0.05)和正常对照组(P<0.01),但rs11568820和rs7975232位点无显著性差异。回归分析结果显示,rs1544410位点AG基因型和rs731236位点CT基因型为糖尿病肾病发病的独立危险因素(P=0.009)。
血清25-羟基维生素D水平低下与2型糖尿病及糖尿病肾病发病有关,VDR基因多态性与糖尿病肾病发病相关,其rs1544410位点A等位基因和rs731236位点C等位基因可能是2型糖尿病肾病的易感基因。