妊娠早期意外诊断的Gitelman综合征一例及其家系基因突变分析
2016年10月
中华内分泌代谢杂志，第32卷第10期 第869页-第871页
宋丹丹|梁慧|郭燕燕|李红梅|李佳|张松|金文胜
参考文献
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患者(先证者)女性，27岁，孕10周，因2周前产检意外发现低钾血症于2015年4月8日入院，平素无心悸、气促、手足麻痹、肌无力等症状；无妊娠剧吐症，无高血压病史；初胎妊娠；血压111/80 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，体重指数(BMI)19.15 kg/m2，发育正常，心肺腹及神经系统查体阴性。
辅助检查：(1)血气分析：pH 7.51～7.57、氧饱和度99.2%、氧分压117～121 mmHg、二氧化碳分压23～25 mmHg、实际碳酸氢根19～22 mmol/L、标准碳酸氢根26～29 mmol/L、缓冲碱46～50 mmol/L、全血碱剩余－1.4～－2.0 mmol/L。肺功能：肺潮气量0.63L，呼吸频率19.67次/min，每分通气量(潮气量×呼吸频率)为12.41 L/min(正常参考范围4.06～4.38 L/min，下同)，提示明显的过度通气。上述结果提示代谢性碱中毒合并呼吸性碱中毒。(2)电解质紊乱见表1，存在典型的Gitelman综合征(GS)改变：低血钾、低血镁、低尿钙。(3)根据血气和电解质计算的阴离子间隙为23.4 mmol/L，提示存在代谢性酸中毒。(4)肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)明显激活：卧位血浆肾素活性7.52 μg·L－1·h－1(0.42±0.4)、血管紧张素Ⅱ649.53 μg/L(40.2±12)、醛固酮226.94 ng/L(59.5～174)，因怀孕未行立位检测。(5)碱性尿和低比重尿：尿pH 7.0～8.0、比重1.005～1.011。(6)妊娠相关检查：彩超显示孕11周，宫腔内见孕囊回声，孕囊大小约67 mm×43 mm，胎儿头臀径约43 mm，胎心率167次/min，卵黄囊可见；人绒毛膜促性腺激素(hCG)18 000 IU/L。(7)其他：24h尿甲氧基肾上腺素296 μg(0～350)、24h尿甲氧基去甲肾上腺素156 μg(0～600)；皮质醇节律8∶00为744.2 nmol/L、16∶00为257.7 nmol/L、24∶00为122.2 nmol/L，ACTH 8∶00为3.59 pmol/L、16∶00为1.19 pmol/L、24∶00为0.781 pmol/L。临床诊断：GS合并妊娠。给予补钾并监测电解质及胎儿发育。随访：妊娠28周之前，血钾3.4～3.5 mmol/L之间，补钾量方案为每日氯化钾12 g及门冬氨酸钾镁0.42 g，妊娠28周至34周，血钾3.1～3.2 mmol/L，补钾方案每日氯化钾12 g。于37周＋3日，顺产一正常男婴，体重3.25 kg，身长50 cm，产后12周复查血钾为3.3 mmol/L，补钾方案为每日氯化钾6 g。患者一直没有症状。婴儿出生时和出生后情况良好，血钾3.8 mmol/L。
患者血清电解质浓度及24h尿电解质排泄(3次)
患者血清电解质浓度及24h尿电解质排泄(3次)
注：患者口服氯化钾9～12 g/d，妊娠及产后随访血钾波动于3.1～3.3 mmol/L，期间无任何不适
家系其他3个成员：姐姐31岁，半年前因心悸于当地医院检查发现血钾低(2.1～2.2 mmol/L)；父亲56岁，母亲56岁，血钾均正常(3.8～4.2 mmol/L)，双亲均无症状，血钾和其他电解质、尿常规检查正常。先证者姐姐于半年前出现轻度心悸，查血钾2.1 mmol/L，血镁0.71 mmol/L，尿pH值6.4，肾脏超声检查正常，常规口服补钾后多次复查血钾仍在3 mmol/L以下认定其外显发病。
基因突变位点及其影响：使用Illumina hiseq2500二代DNA测序方法对SCL12A3、BSND、CLCNKA、CLCNKB、KCNJ1、SLC12A1、CASR基因进行了测序分析，发现先证者及其姐姐、母亲均在SLC12A3基因2号外显子上存在2个单杂合突变位点(表2)：c：407T>A和c：409G>C；对其进行一代Sanger法验证，SLC12A3基因上游引物5′-TCAGTGGGCTGGATGCAGAGACG-3′，下游引物5′-GGGAAGAACAGGATTCAGGCAAGCTGG-3′，产物1 455 bp。结果确认此2个位点突变(图1)。此2个突变使相邻的2个氨基酸密码子发生错义突变：p：136F>Y，p：137G>R。PROVEAN软件预测蛋白质结构改变均为有害；其父亲该基因未见任何突变；同时4人均未发现大基因片段重排或缺失。经与NCBI的SNP库比对可排除突变位点为核苷酸多态性，且二者在HGMD数据库中均未见报道，提示为新发现位点。所有成员均未检测到Batter综合征其他相关基因BSND、CLCNKA、CLCNKB、KCNJ1、SLC12A1疾病相关性突变。
二代高通量SLC12A3基因突变检测
二代高通量SLC12A3基因突变检测
注：p.136F>Y由非极性氨基酸转变为极性氨基酸，p.137G>R由非极性氨基酸转变为碱性氨基酸，相当于2个相邻非极性氨基酸转变为极性氨基酸
关于妊娠合并GS的临床特殊性：先证者有低钾血症、肾性失钾失钠、低血镁、低尿钙、RAAS明显激活以及低钾血症家族史等特点，符合GS诊断标准[1]；除此之外，尚有过度通气、阴离子间隙增高等，由此出现多重酸碱平衡紊乱，而GS一般仅有继发于低钾血症的代谢性碱中毒，这可能与妊娠期激素的变化有关。妊娠高水平孕激素刺激呼吸中枢，从而使每分通气量增加、过度通气；中晚期妊娠孕激素还可使连接肋骨和胸骨的韧带松弛，抬高横膈并减小胸腔体积，这使总肺活量、功能残气量进一步降低，加之孕妇的氧耗量增加，机体对缺氧的敏感性大幅度升高，从而引起生理性的血氧分压升高、二氧化碳分压降低[2]。先证者的肺功能检查已显示出明显的过度通气，因而出现呼吸性碱中毒。正常孕妇可通过代偿机制维持血pH值正常，而先证者血pH值严重偏碱，标准碳酸氢根处于正常范围内而阴离子间隙升高(23.4 mmol/L)，提示代谢性代偿机制不足，这可能与严重低钾血症时细胞内外氢/钾交换不足有关，可见低钾碱中毒亦参与其中，这是1例典型的呼碱型三重酸碱失衡。McCarthy等[3]总结了GS合并妊娠的临床研究报告，均发现妊娠时GS低血钾和低血镁有加重趋势，原因主要是妊娠时肾血流及肾小球率过滤增加，生理性球管平衡机制启动，使肾小管重吸收成比例增加以维持血容量和电解质平衡，但在GS患者钠氯共转运体(NCC)障碍时，其继发和原发的电解质丢失均加重。此外，妊娠孕激素的抗盐皮质激素作用减弱、分娩时肾上腺素能β受体活性增加等可能均参与了低血钾的发生，未曾报告本例呼吸性碱中毒加重低血钾的情形。尽管低血钾和低镁血症持续存在，但有文献总结的18例24次妊娠中，除了6例羊水过少和1例生长迟缓外，没有发现明显的不良后果，多次正常妊娠史也常见[4,5],也鲜见心律失常出现，因此主张常规治疗即可，可以适当增加补钾补镁的剂量，不需要特别的药物进行保钾治疗。
患者家系SLC12A3基因突变分析：对GS家系的基因分析国内报道较少[6,7]，早期秦岭等[8]报道了26例GS患者的SLC12A3基因一代测序结果，在所有病例均发现了变异，其中16例为复合杂合突变，6例为单杂合突变，6例为纯合突变。Luo等[9]报道了2例GS大家系基因分析，单杂合突变占77%以上，其余为纯合突变。国外2011年曾有一项大型研究涉及448例患者，采用多重连接探针扩增技术(MLPA)及短荧光片段的定量多重PCR(QMPSF)技术，结果显示74.9%为复合杂合突变，18%为单杂合突变，25%为纯合突变，其中单杂合突变中又有47%存在外显子大片段重排，因而考虑单杂合突变者的致病性可能还与大基因片段重排相关[10]。本研究采用二代测序，对全外显子组即目标区域DNA进行高通量测序，更有可能发现引起功能改变的突变，且具经济、高效的优点。结果在先证者及其姐姐、母亲的SLC12A3基因上发现了2个相同的单杂合突变位点，其父亲在该基因上无变异，很好地描绘了家系的遗传途径，即子代的GS相关突变遗传自母亲(图2)。许多研究表明，SLC12A3突变具有明显的表型多样性，即使同一家族中发病亦有轻重[11]。本研究家系中母亲并未发病，一方面与遗传异质性有关，另一方面其子代可能合并目前尚不明确的其他突变方式，如内含子或与NCC功能调节相关的基因突变。但是也不能排除高通量测序遗漏了另一个等位基因的突变位点或影响功能的多态性。SLC12A3编码1 002～1 030个氨基酸，其晶体结构目前尚未明确，推测其为跨膜蛋白，由12个疏水的跨膜域及细胞内的N端和C端组成。已知的重要活性调节机制为丝氨酸/苏氨酸磷酸化及去磷酸化，这些保守的位点几乎均位于细胞内N端，对SLC12A3产物向胞膜的转运以及在胞膜上的数量等环节有着重要影响[12]。此外其细胞外一连接两跨膜区的长环上还存在2个N-糖基化位点，这一翻译后修饰是其在胞膜上正确折叠和转运所必需的[13]。已报道的GS相关性突变位点广泛分布于SLC12A3基因上，其中有些可能涉及上述磷酸化位点的变异，如亚洲人群中发现的Thr60Met突变，有些聚集在细胞内C端，但大部分突变的意义并未明确[14,15,16,17]。本研究发现的2个突变位点位于SLC12A3第一个跨膜区起始端(图3)，为2个相邻氨基酸：第136位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第137位的甘氨酸突变为精氨酸。基于其位于疏水跨膜区的特点，推测氨基酸性质的改变，即疏水的苯丙氨酸突变为亲水的酪氨酸，中性的甘氨酸突变为碱性的精氨酸，可能对其结构域的稳定性产生影响，进而影响NCC在细胞膜上的功能。
注：基因检测发现存在可能对蛋白质功能有害的SLC12A3基因的单杂合突变，另一个等位基因未发现异常可能与检测方法和未发现的突变有关，此类未明了的复合杂合突变使GS貌似显性遗传，但其占到了目前报道的近30%的病例
注：箭头所示为SLC12A3基因突变位置在细胞内氨基端近第一跨膜片段
综上所述，通过对本例GS患者的临床及家系基因学研究，我们对GS合并妊娠这一罕见状态的临床特殊性有了一定的了解，并通过对其家族成员SLC12A3基因测序分析发现了2个尚未报道的外显子错义突变位点。值得注意的是，我国目前的普通产检并无电解质检查，因此若非既往已诊断，GS患者很可能毫无症状地完成了妊娠分娩。这例妊娠早期诊断GS的病例为我们了解妊娠特殊生理背景下GS的非典型表现提供了经验，有助于我们提高对这一罕见疾病的诊断能力。