高脂饮食及久坐不动的工作与生活方式导致人体能量的摄入远超能量的消耗，随后体内储存能量的脂肪细胞数目的增加，体积的肥大，引发肥胖症的发生。脂肪细胞主要分为白色脂肪(White adipose tissue, WAT)和棕色脂肪(Brown adipose tissue, BAT)。WAT主要起储存能量及机械保护作用，主要分布于内脏、皮下和性腺周围，其增殖与肥大是导致肥胖的主要原因；BAT主要通过解耦联蛋白1(Uncoupling protein 1, UCP1)介导以产热的形式消耗能量，是出生时和儿童早期重要维持体温的组织，最初认为BAT随着年龄增加而逐步退化、消失。但近年研究表明，成人体内也存在棕色脂肪，并对人体全身能量消耗具有显著作用，因此，通过增加棕色脂肪组织的活性或促进脂肪棕色化，可能成为一种预防或治疗肥胖及其相关并发症的方法。
葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(Glucose-dependent insulinot-ropic polypeptide，GIP)又称为抑胃肽(gastric inhibitory peptide)，是主要的肠促胰素之一，其作用既往被认为是中和胃酸，保护小肠黏膜，减少食物从胃进入肠道，抑制胃排空和胃酸分泌。后因实验证实缺乏GIP受体(GIPR)的小鼠对高脂饮食诱导的肥胖有抵抗作用，而再次点燃了科学家们研究它的热情[1]。关于GIP在糖脂代谢中的可能作用，我们已作详细叙述[2]，之前关于GIP作用的研究主要集中在白色脂肪细胞，目前鲜有GIP与棕色脂肪细胞相关的研究报道，为此本研究拟观察SD大鼠原代棕色脂肪细胞分化过程中是否表达GIP受体，并进一步研究其可能的功能。
(1)实验动物：1周龄SD大鼠8只，体重15～20 g，购自武汉大学动物实验中心[证书编号：SCXK(鄂)2008-0004，SPF级]。(2)试剂：RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR引物(上海生物工程有限公司)，胎牛血清白蛋白、胎牛血清(Gibco公司)，Ⅱ型胶原酶、青链霉素双抗、胰酶(美国Sigma公司)，cAMP酶联免疫试剂盒、UCP-1一抗(上海瑞晶生物科技)，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(CREB)一抗(美国Neogen公司)，GIPR一抗(康肽生物科技北京有限公司)，GIP(美国Phoenix pharmaceuticals公司)；脂肪组织消化液配方：Ⅱ型胶原酶1.5 g/L，牛血清白蛋白20 g/L，HEPES 1.2 g/L，使用含钙、镁的PBS定容，调pH 7.4，50 ml EP管分装，用时37℃预热。棕色脂肪细胞培养液配方：DMEM高糖培养基88.5 ml，胎牛血清10%，双抗1%，胰岛素20 nmol/L，地塞米松5 μmol/L。
(1)SD大鼠原代棕色脂肪细胞获取与培养：断颈法处死1周龄SD大鼠，分离并获取原代棕色脂肪细胞，6孔板培养，隔日换液。(2)普通PCR：RNA提取试剂盒提取组织或细胞总RNA，逆转录为cDNA。取cDNA 2 μl，反应体系为25 μl，引物序列及反应条件见表1，反应结束后取2 μl行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察结果，照相。(3)免疫组化：棕色脂肪组织与原代棕色脂肪细胞分别制片，按文献所示方法行免疫组化染色、观察。(4)细胞干预：细胞传至第3代，按104个/孔接种。6孔板置于5% CO2、37℃培养箱中，至细胞80%成熟(第9天)。更换新鲜培养液，12 h后分别予以1、10、100 nmol/L的GIP干预24 h，收集细胞进行下一步试验。(5)油红O染色：棕色脂肪细胞爬片按文献所示方法行油红O染色后显微镜下观察、照相。(6)细胞内cAMP浓度测定：取经不同浓度GIP干预后的棕色脂肪细胞，分离获取细胞内液后按照cAMP酶联免疫试剂盒说明书进行测定，根据标准曲线计算棕色脂肪细胞内cAMP的浓度。(7)Western印迹法：取经不同浓度GIP干预后的棕色脂肪细胞，按文献所示方法行Western印迹后以GAPDH为内源性参照，计算蛋白相对表达量，并进行统计分析。
 | 表1 PCR引物序列及反应条件 |
PCR引物序列及反应条件
| 基因 | 引物序列 | 产物长度(bp) | 反应条件 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 变性 | 退火 | 延伸 | |||
| GIPR | F：5′-CTCTCCAGTCCCACACAGATTT-3′ | 213 | 94℃ 30 s | 58℃ 30 s | 72℃ 45 s |
| R：5′-TGATTGCTCTCCTTTTGTCTTG-3′ | |||||
| UCP-1 | F：5′-GTGAGTTCGACAACTTCCGAAGTG-3′ | 620 | 92℃ 45 s | 55℃ 60 s | 72℃ 60 s |
| R：5′-CATGAGGTCATATGTCACCAGCTC′-3′ | |||||
| GAPDH | F：5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ | 150 | 92℃ 45 s | 55℃ 60 s | 72℃ 60 s |
| R：5′-GGTGAGGATCTTCATGAGGT-3′ | |||||
注：GIPR：葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽受体；UCP-1：解耦联蛋白1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；F：上游引物；R：下游引物
用SPSS 20.0软件(武汉大学图书馆购买)进行统计学分析，符合正态分布的计量数据采用
±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
取自SD大鼠肩胛棕色脂肪组织，GIPR免疫组化显示(图1A)，细胞内有大量空泡样区域，部分呈环状，周围见散在分布的浅棕色至深棕色着色区，提示细胞内存在GIPR蛋白；UCP-1免疫组化检测结果显示，棕色脂肪组织内呈现大量着色区域，如图1B，细胞内有大量UCP-1表达，呈现明显的棕色脂肪细胞特征。成熟原代棕色脂肪细胞GIPR、UCP-1免疫组化结果见图1C和图1D，细胞内见大量着色区，提示细胞内表达相应蛋白。
注：A：棕色脂肪组织GIPR表达(免疫组化×200)；B：棕色脂肪组织UCP-1表达(免疫组化×200)；C：原代棕色脂肪细胞GIPR表达(免疫组化×100)；D：原代棕色脂肪细胞UCP-1表达(免疫组化×100)；GIPR:葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽受体；UCP-1：解耦联蛋白1
取自SD大鼠原代棕色脂肪组织的脂肪细胞经诱导后进入分化阶段，镜检发现细胞开始皱缩并逐渐出现脂滴，脂滴颗粒在细胞核周围出现，逐渐增多、增大，直至遍布细胞内，细胞核可被脂滴挤到周围。诱导分化6～9 d，80%～90%的细胞分化产生脂滴，光镜下可见大量胞内含有大小不等透光区(图2A)，油红O染色后棕色脂肪细胞内出现大量红染颗粒(图2B)。PCR检测发现棕色脂肪组织内表达GIPR mRNA，目标PCR产物与已知表达GIPR的脑组织出现在相同区域(图3A)；PCR检测原代棕色脂肪细胞分化不同时间点(分化第1、4、7、10天)GIPR的mRNA表达水平，结果显示自分化第4天开始至分化终末期，GIPR开始表达并呈上升趋势(图3B)。
注：A：原代棕色脂肪细胞光镜(×100); B：原代棕色脂肪细胞油红O染色(×100)
注：A：棕色脂肪组织GIPR mRNA表达；B：棕色脂肪细胞分化不同天数GIPR mRNA表达水平；GIPR：葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽受体；BAT：棕色脂肪组织；Brain：脑组织
之前已有报道，在白色脂肪细胞内，GIP通过上调胞内PPAR的表达活化GIPR[3]，属于正反馈调节。本研究结果显示，GIP干预棕色脂肪细胞24 h后，Western印迹法测得细胞内GIPR、UCP-1及CREB的表达量发生变化，10 nmol/L的GIP下调GIPR、UCP-1及CREB的表达，而1、100 nmol/L的GIP促进这3个基因的表达(图4)。经GIP干预后细胞内cAMP浓度明显增高(图5，P<0.05)。
注：p-CREB：磷酸化cAMP反应元件结合蛋白；余略语同表1
注：与对照组相比，aP<0.05
BAT因肉眼下相对于WAT呈现棕色外观而得名；BAT是产热器官，很早即证实在小型哺乳动物和新生儿体内含有丰富的BAT，研究发现它随年龄增长逐渐减少。大量研究显示，啮齿类动物棕色脂肪组织产热作用对机体稳定调节和体重控制均有作用，进一步研究发现，棕色脂肪组织可能在动物一生中均对体重起调节作用[4]。一般情况下棕色脂肪组织产热是极其低效的，但其激活后则能出现显著的能量消耗。实验证实，在人类，激活棕色脂肪导致的能量消耗可达整体能量消耗的15%[5,6]。过度进食高能量食物是诱导棕色脂肪组织产热的一种有效方式，而不能有效地利用这些食物中的能量则最终导致了肥胖[7]。为此，很多学者认为通过增加BAT产热作用增加机体脂肪消耗是治疗肥胖、糖尿病及其并发症的一种可行性方法。
GIP在白色脂肪细胞脂质储存与利用中起着重要作用。空腹状态下，GIP能刺激脂肪分解，但其脂解作用可被胰岛素抑制[8]。在高浓度游离脂肪酸(FFA)存在时，GIP能增强前脂肪细胞和成熟的脂肪细胞内脂肪酶的活性[9]。细胞水平实验证实，GIP能抑制胰升糖素和异丙肾上腺素介导的脂肪分解，即GIP促进脂肪细胞内脂肪酸被优先合成脂质并堆积而非作为能量被使用[10]。
研究发现，在存在胰岛素的情况下，GIP能增强体外培养的3T3-L1脂肪细胞、啮齿动物脂肪细胞和人类皮下脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性，进一步研究显示GIP通过影响FFA的摄取在人类脂肪细胞储存三酰甘油上起重要作用。在前脂肪细胞上，GIPR的表达非常低，但在3T3-L1和人前脂肪细胞分化过程中，GIPR mRNA和蛋白的表达迅速增加。3T3-L1细胞分化同PPAR-γ上调有关，在已经分化完全的3T3-L1细胞，给予PPAR-γ激动剂后GIPR表达增加而PPAR-γ抑制剂则减少其表达，用RNA干扰技术阻断PPAR-γ后GIPR表达水平明显降低，由此可见PPAR-γ是调节脂肪细胞GIPR表达的关键转录因子，但目前尚不清楚胰岛素在其中的作用[11]。综上所述，GIP在机体能量平衡中起重要作用，因此，基于GIP/GIPR信号通路在能量平衡中的重要调控作用，该信号通路可能成为治疗肥胖、糖尿病及其并发症新的靶点[1,11]。
本研究结果显示，光镜下，分离培养的原代棕色脂肪细胞多呈不规则梭行，内有大量点状透亮区；诱导分化后的原代棕色脂肪细胞经油红O染色后见细胞内有大量区域被染色，部分成环状；分离自SD大鼠肩胛的棕色脂肪组织采用免疫组化鉴定，UCP-1的表达均匀分布于组织各细胞内，通过以上鉴定，我们分离的组织为棕色脂肪组织。
本研究发现，在棕色脂肪细胞诱导分化的第4天检测到GIPR的mRNA开始表达，随着细胞的分化成熟，GIPR的mRNA表达水平上调，经免疫组化进一步鉴定，GIPR在棕色脂肪细胞内有表达，而其可能的作用目前没有报道。GIP也属于胰升糖素超家族肽，在白色脂肪细胞，GIP与GIPR结合后可导致细胞内cAMP浓度增加[12]；在支配棕色脂肪组织的交感神经兴奋时，交感神经释放的儿茶酚胺类物质通过作用于棕色脂肪细胞上的β3肾上腺素能受体导致细胞内cAMP浓度增高，进而通过蛋白激酶A(PKA)途径引起细胞核内CREB改变，最终影响核转录过程[13,14]。是否GIP同棕色脂肪细胞上的GIPR结合后也引起细胞内cAMP浓度改变，cAMP作为第二信使而进一步发挥作用之前尚不清楚。本研究发现，分化成熟的棕色脂肪细胞予以不同浓度的GIP干预24h后均可导致细胞内cAMP浓度增加，以100 nmol/L时最为明显。与此对应的是，细胞内GIPR、CREB、UCP-1水平也发生了改变，但并未呈现剂量依赖现象，1和100 nmol/L的GIP干预后，细胞分化过程中GIPR、CERB、UCP-1表达增加，而10 nmol/L时三者表达均明显降低，具体原因目前尚不清楚。
寒冷刺激是诱导棕色脂肪组织产热的主要因素之一，而有研究显示，寒冷刺激在导致棕色脂肪功能增强的同时显著增加肠间GIP浓度[15]，并且这种改变是独立于进食的。当然寒冷刺激作用对循环GIP浓度的提升是有限的，它不可能同食物刺激(特别是脂肪)那样引起GIP浓度快速增高；为此，如果血中GIP进一步增高，那机体一定有了另外的能量来源(主要是进食)，GIP在此时的作用就转向能量存储(故而会出现UCP-1表达下降)；而当大量高能量食物进入，循环GIP浓度会进一步升高，此时GIP可能参与饮食诱导的产热，在能量收支平衡中起作用。
为此，我们推测，血中低浓度的GIP促进棕色脂肪组织产热作用的意义在于维持体温的恒定，中等浓度的GIP则主要呈现存储能量的作用，高浓度则参与饮食诱导产热，在能量收支平衡中起作用。因而我们认为上述现象是可能的，但其中可能涉及众多复杂机制，具体尚需进一步证实。基于已有文献，我们推测GIP对棕色脂肪细胞的产热调控具直接作用，但具体涉及机制及可能的生理意义尚需更多研究证实。
虽然本研究发现SD大鼠棕色脂肪组织表达GIPR，并且在原代棕色脂肪细胞分化过程中可能参与棕色脂肪功能，但该研究仍存在不少问题：(1)实验采用的是SD大鼠原代棕色脂肪细胞，实验过程中有很多干扰因素可能影响研究结果；(2)予以GIP干预前未改用无血清培养液对结果有一定影响；(3)未加入一些棕色脂肪特异性基因(如PRDM16等)，研究数据少；(4)细胞内cAMP浓度检测方法未采用放射免疫法，结果可信度有限；(5)GIP/GIPR后信号通路中检测指标少，代表性不强。
采用葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)干预诱导分化成熟的棕色脂肪细胞，以Western印迹分析GIP受体(GIPR)、解耦联蛋白1(UCP-1)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)等的蛋白表达，ELISA检测细胞内cAMP浓度变化。结果显示，分离培养的大鼠脂肪细胞光镜下呈典型棕色脂肪细胞形态，油红O染色可见细胞内大量脂滴聚集；免疫组化检测可见细胞内UCP-1表达；在棕色脂肪细胞分化后期GIPR mRNA表达量呈上升趋势，免疫组化检测可见棕色脂肪细胞内GIPR蛋白表达。1和100 nmol/L的GIP显著升高棕色脂肪细胞GIPR、UCP-1和CREB的蛋白表达，10 nmol/L时明显降低；各种浓度GIP干预24 h后棕色脂肪细胞内cAMP浓度均显著升高(P<0.05)。结果提示GIPR可能参与棕色脂肪细胞的分化。