随着我国经济发展，工作方式与饮食结构也随之发生变化，导致肥胖人群逐年上升，肥胖所致的代谢综合症患者也呈上升趋势。2型糖尿病是肥胖症患者的常见慢性代谢性疾病。据临床调查统计，我国20岁以上人口中，糖尿病患者人口比例达9.7%(约9 240万)；另外还有15.5%人口(约1.48亿)处于糖尿病前期阶段，这些数据表明我国糖尿病患者的绝对人数已居世界首位，并且绝大部分属于2型糖尿病[1]。目前，有关2型糖尿病发生与发展的分子机制还不十分清楚，但可以肯定的是胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生与发展的重要因素[2]。大量研究表明导致胰岛素抵抗的因素主要有以下3个方面：异常的脂质代谢产物；激活的未折叠蛋白反应(unfold protein response, UPR)和机体固有免疫信号途径[3]。值得注意的是，c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases, JNK)的激活均发生于上述3种主要导致胰岛素抵抗的因素之中[3]。
JNK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族。研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡)的过程中具有至关重要的作用[4]。除JNK外，MAPKs家族还包括其他丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，如ERK(extracellular signal-regulated kinase)和p38 MAPK[5]。动物活体研究结果表明，JNK1的敲除可缓解小鼠高脂饮食诱导的肥胖，并提高其胰岛素敏感性；进一步研究发现，JNK的激活可使胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate1，IRS1)的307位丝氨酸发生磷酸化，该磷酸化修饰可阻断IRS1与其下游因子的结合，从而抑制胰岛素信号转导[6]。但最近的研究表明，IRS1的307位丝氨酸磷酸化不但没有阻断胰岛素信号途径的作用；相反，可以促进胰岛素信号转导，从而提高胰岛素敏感性[7]。因此，有关JNK活性对胰岛素信号通路的影响还不清楚。本研究通过各种不同的JNK抑制剂处理HepG2细胞，研究在JNK活性受到抑制的情况下，胰岛素信号通路的变化，旨在揭示JNK在胰岛素信号通路中的作用。
人肝癌细胞株HepG2(ATCC, HB-8065)购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。HepG2细胞培养于DMEM培养基(Gibico)，内含10% FBS(Sigma)。细胞培养置于细胞培养箱，37℃，5% CO2。在进行处理之前，细胞培养基换成低糖无血清DMEM，饥饿培养6 h后加入不同JNK抑制剂(JNKi-Ⅲ，JNKi-Ⅴ，JNKi-Ⅷ，SP600125，均购自Calbiochem公司)处理12 h，随后用胰岛素(10 nmol/L; Sigma)处理5 min。处理结束后收集细胞，加入细胞裂解液(25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；2 mmol/L Na3VO4；10 mmol/L NaF；10 mmol/L Na4P2O7；1 mmol/L EGTA；1 mmol/L EDTA；1% NP-40；10μg/ml leupeptin；10 μg/ml Aprotinin；2 mmol/L PMSF；20 nmol/L Okadaic acid)，细胞经充分裂解后12 000 rpm离心15 min(4℃)。吸取上清用BCA法测定各样品蛋白浓度，根据所测蛋白浓度制备全细胞蛋白样品，用于后续蛋白分析。
Western印迹法检测如前文所述[8]。操作过程简述如下，取上述制备好的全细胞蛋白样品50 μg进行SDS-PAGE电泳分离(10%分离胶和4%浓缩胶)，通过湿法转印法将分离胶中蛋白转移至0.45 μm的PVDF膜上，恒压100 V转膜120 min；PVDF膜经封闭1 h后，加入一抗：兔单克隆抗体p-ERK及t-ERK、兔单克隆抗体p-P38及t-P38、兔单克隆抗体p-Akt及t-Akt、兔单克隆抗体p-GSK3β及t-GSK3β、兔单克隆抗体p-JNK及t-JNK、兔单克隆抗体p-cJun、兔单克隆抗体Actin及兔单克隆抗体GAPDH(以上抗体均购自于Cell Signaling Technology公司，1∶1 000稀释)。4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10 min；加入HRP标记的相应二抗作用液(Santa Cruz Biotechnology，1∶10 000稀释)，室温摇动孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min；ECL(Millipore)化学发光，显影，拍照；Western印迹法检测条带用凝胶成像仪分析系统Quantity One软件扫描灰度值。计算磷酸化蛋白与总蛋白或内参蛋白灰度值的比值，进行统计学分析。
实验所用三对针对JNK1基因的siRNA由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。转染前，HepG2细胞培养基换成Opti-MEM(Invitrogen)。采用脂质体方法进行转染，本实验所采用的脂质体为Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，按照该试剂实验操作流程进行转染。转染72 h后，提取细胞总RNA，用实时定量PCR方法检测基因沉默效率。
细胞处理结束后，利用Trizol(Invitrogen)抽提细胞总RNA，在逆转录试剂盒iScript cDNA(Bio-Rad)的作用下将RNA逆转录成cDNA，以此cDNA为模板对JNK1基因表达进行检测。定量PCR试剂盒采用FastStart Essential DNA Green master(Roche)，检测仪器为StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。各检测基因序列如下。JNK1上游引物：5′-TGTGT-GGAATCAAGCACCTTC-3′，JNK1下游引物：5′-AGGC-GTCATCATAAAACTCGTTC-3′；18S上游引物：5′-AGT-CCCTGCCCTTTGTACACA-3′，18S下游引物：5′-CGTT-CCGAGGGCCTCACT-3′。
实验结果采用SPSS 17.0统计软件分析，单因素组间数据差异分析采用t检验方法分析，多因素组间差异分析采用ANOVA分析，P<0.05认为有显著差异。
为研究JNK活性对胰岛素信号通路的影响，我们用不同浓度的JNK抑制剂JNKi-Ⅷ(2.5、5、10及20 μM)处理细胞12 h以抑制JNK活性。首先，我们研究了所选用的抑制剂及处理方式是否可抑制JNK的活性。如图1A所示，不同浓度的JNKi-Ⅷ对JNK蛋白自身的磷酸化没有影响，但是对JNK下游因子cJun的磷酸化具有抑制作用，且这种抑制作用呈浓度依赖性(图1B)。同时，我们也检测了MAPK家族其他成员的表达变化。结果表明，JNKi-Ⅷ对P38和ERK蛋白的磷酸化水平没有影响。以上研究结果表明，JNK抑制剂JNKi-Ⅷ处理HepG2细胞12 h可显著抑制JNK的活性，但对P38和ERK没有影响。
Effects of JNKi-Ⅷ on mitogen-activated protein kinases(MAPK)signaling pathways in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；JNKi：JNK抑制剂JNK inhibitor；p-：磷酸化Phosphorylated；t-：总Total；ERK：胞外调控蛋白激酶Extracellular regulated protein kinase；vs 0, aP<0.05
Effects of JNKi-Ⅷ on mitogen-activated protein kinases(MAPK)signaling pathways in HepG2 cells
上述实验结果表明JNKi-Ⅷ可显著抑制HepG2细胞中JNK的活性。在接下来的实验中，我们研究了JNKi-Ⅷ对胰岛素信号通路的影响。如图2A所示，在胰岛素的刺激下，磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化GSK3β(p-GSK3β)蛋白表达水平显著上升，说明胰岛素信号通路被激活(图2B)。但JNK抑制剂JNKi-Ⅷ可减弱胰岛素的这种对p-Akt和p-GSK3β的刺激作用，并且这种减弱作用呈浓度依赖方式(图1A，图1B)。说明在HepG2细胞中，用JNKi-Ⅷ抑制JNK活性可阻碍胰岛素信号通路。
Effects of JNKi-Ⅷ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；JNKi：JNK抑制剂JNK inhibitor；Insulin：胰岛素(10 nmol/L)；p-：磷酸化Phosphorylated；t-：总Total；GSK：糖原合成酶激酶Glycogen synthase kinase；vs Insulin(－)JNKi-Ⅷ(－), aP<0.05；vs Insulin(＋)JNKi-Ⅷ(－), bP<0.05
Effects of JNKi-Ⅷ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
为进一步探讨JNK活性对胰岛素信号通路的影响，我们选用了另外一种JNK抑制剂SP600125处理HepG2细胞。研究结果表明，在低浓度SP600125(2.5、5 μM)处理下，与仅用胰岛素处理组相比，p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平呈下降趋势，但未达到统计学差异水平(图3A，图3B)。而高浓度SP600125(10、20 μmol/L)处理则可显著性地抑制胰岛素刺激作用下的p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平(图3A，图3B)。这些结果说明抑制JNK活性可降低HepG2细胞中的胰岛素信号途径。
Effects of JNK inhibitor SP600125 on insulin signaling pathway in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；Insulin：胰岛素(10 nmol/L)；p-：磷酸化Phosphorylated；t-：总Total；GSK：糖原合成酶激酶Glycogen synthase kinase；vs Insulin(－)SP600125(－), aP<0.05；vs Insulin(＋)SP600125(－), bP<0.05
Effects of JNK inhibitor SP600125 on insulin signaling pathway in HepG2 cells
在接下来的实验中，我们采用另外一种JNK抑制剂JNKi-Ⅲ处理细胞，并探讨在该抑制剂作用下细胞内胰岛素信号途径的变化。如图4所示，在没有胰岛素刺激的情况下，JNKi-Ⅲ对p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平没有显著影响。在胰岛素作用下，p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平明显上升，低浓度JNKi-Ⅲ(1 μmol/L)处理对胰岛素刺激下的p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平没有明显影响；而高浓度JNKi-Ⅲ(2 μmol/L)处理则可显著抑制胰岛素的这种刺激作用(图4A, 图4B)。
Effects of JNKi-Ⅲ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；JNKi：JNK抑制剂JNK inhibitor；Insulin：胰岛素(10 nmol/L)；p-：磷酸化Phosphorylated；t-：总Total；GSK：糖原合成酶激酶Glycogen synthase kinase；vs Insulin(－)JNKi-Ⅲ(－), aP<0.05；vs Insulin(＋)JNKi-Ⅲ(－), bP<0.05
Effects of JNKi-Ⅲ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
我们用JNKi-Ⅴ抑制JNK活性，以期进一步证实以上发现。结果发现，如同其他抑制剂的作用效果，JNKi-Ⅴ处理确实可抑制胰岛素刺激下的p-Akt和p-GSK3β蛋白表达水平，并且呈剂量依赖方式(图5A，图5B)。
Effects of JNKi-Ⅴ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；JNKi：JNK抑制剂JNK inhibitor；Insulin：胰岛素(10 nmol/L)；p-：磷酸化Phosphorylated；t-：总Total；GSK：糖原合成酶激酶Glycogen synthase kinase；vs Insulin(－)JNKi-Ⅴ(－), aP<0.05；vs Insulin(＋)JNKi-Ⅴ(－), bP<0.05
Effects of JNKi-Ⅴ on insulin signaling pathway in HepG2 cells
在上述实验中，我们采用不同的小分子化合抑制剂抑制JNK的活性，为排除这些小分子化合物的非特异性影响，在接下来的实验中，我们采用小干扰RNA(siRNA)的方法下调JNK的基因表达，然后研究JNK对胰岛素信号途径的影响。为下调JNK的基因表达，我们合成了3对针对JNK1基因的siRNAs，并通过脂质体转染的方法将这些siRNAs转进HepG2细胞。在转染72 h后收集细胞总RNA检测JNK1 mRNA水平的表达。结果表明，在3对siRNA中，第1对siRNA(siRNA-1)可大幅降低JNK的表达(图6A)。因此，我们选用JNK1 siRNA-1进行后续实验。如图6B所示，在无胰岛素刺激情况下，p-Akt表达水平较低。而在胰岛素作用下，p-Akt表达显著增强，但在JNK1 siRNA-1转染细胞中，胰岛素刺激的p-Akt水平明显降低。
Effects of JNK1 knockdown on insulin signaling pathway in HepG2 cells
注：JNK：c-Jun氨基端激酶c-Jun NH2-terminal kinases；NC：阴性对照Negative control；siRNA:小干扰RNA Small interference RNA；Insulin：胰岛素(10 nmol/L)；p-：磷酸化Phosphorylated
Effects of JNK1 knockdown on insulin signaling pathway in HepG2 cells
既往研究结果表明，JNK激活可阻断胰岛素信号传递，导致胰岛素抵抗；而抑制JNK活性则可以恢复胰岛素信号途径，提高胰岛素敏感性。目前，有关JNK的这些生理作用是直接通过其活性实现的，还是通过其他间接信号通路调控胰岛素信号途径还未可知。为探讨JNK活性对胰岛素信号途径的直接调控作用，本研究采用了不同的JNK抑制剂处理HepG2细胞以抑制JNK活性。我们发现在JNK受到抑制的情况下，细胞内胰岛素信号途径也受到阻断。
JNK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在哺乳动物体内存在三种形式，即JNK1/2/3，其中JNK1/2普遍存在于各组织器官，而JNK3则主要存在于脑、心脏及睾丸等组织中[9]。HepG2细胞属于肝实质细胞，其JNK组成主要包括JNK1/2。在本研究中，我们选用4种不同的JNK抑制剂，其中SP600125、JNKi-Ⅴ及JNKi-Ⅷ属于小分子化合物，其作用机制为抑制JNK的激酶活性，使其不能磷酸化下游因子，从而阻断JNK信号通路。为验证我们所选的抑制剂作用浓度及处理时间是否可有效抑制JNK，我们首先检测了JNKi-Ⅷ对JNK信号通路的影响。结果表明，JNKi-Ⅷ对p-JNK没有影响，但JNK下游因子c-Jun的磷酸化受到显著的抑制。同时，我们也检测了JNKi-Ⅷ是否可影响MAPKs家族中其他两个主要分子的活性，结果表明JNKi-Ⅷ对ERK和p38 MAPK没有明显影响。通过检测胰岛素信号通路中两个关键分子Akt及GSK3β的磷酸化水平得知，JNKi-Ⅷ处理可显著抑制HepG2细胞中的胰岛素信号通路。为进一步证实这一结果，我们又选用了SP600125和JNKi-Ⅴ这两种JNK抑制剂处理细胞，结果发现这两种抑制剂也可阻断胰岛素信号通路。比较这三种抑制剂的作用效果发现，JNKi-Ⅴ的阻断胰岛素信号通路的作用最强，JNKi-Ⅷ次之，而SP600125的作用最弱。这种差异可能与三种抑制剂在HepG2细胞中的效价相关，具体机制还有待进一步研究。
有研究表明，JNK诱导胰岛素抵抗的分子机制在于JNK可磷酸化IRS1的307位丝氨酸，该位点的磷酸化可阻断IRS1与下游底物的结合，从而阻断胰岛素信号通路[6]。但是这一发现受到质疑，因为有研究发现IRS1 307位丝氨酸的磷酸化不但对胰岛素信号通路没有阻断作用；相反，该位点磷酸化可促进胰岛素信号的传递，并提高胰岛素敏感性[7]。与这个发现类似，我们的研究利用小分子化合物(SP600125、JNKi-Ⅴ及JNKi-Ⅷ)直接抑制JNK的激酶活性，使其不能对IRS1的307位丝氨酸进行磷酸化修饰，按照原有理论推测，抑制JNK应该促进胰岛素信号通路。但是，与预期相反，我们发现这三种小分子化合物抑制剂处理均可隔断HepG2细胞中的胰岛素信号通路。为进一步探讨JNK激酶活性与胰岛素信号通路的关系，我们又选用了另外一种作用机制不同的JNK抑制剂JNKi-Ⅲ，它是一种由37种氨基酸组成的多肽，可通过细胞膜，其作用机制是阻断JNK与其下游因子c-Jun的结合，从而阻断JNK信号通路[10]。JNKi-Ⅲ并不直接抑制JNK的蛋白激酶活性，只是阻断了其与c-Jun的结合。如果前面所述的三种小分子化合物是通过直接抑制JNK激酶活性来阻断胰岛素信号通路的，那么这种多肽类抑制剂可能就没有类似作用。但是，我们发现高浓度的JNKi-Ⅲ也能抑制胰岛素信号的传递。当然，目前尚不能排除JNKi-Ⅲ也可影响JNK对IRS1 307位丝氨酸的磷酸化修饰；但以上结果说明，抑制JNK信号通路阻断胰岛素信号途径可能与IRS1 307位丝氨酸磷酸化没有关系。最近，有报道发现除307位丝氨酸的磷酸化，IRS1 302位的丝氨酸磷酸化也是胰岛素信号传递所需要的[11]。抑制JNK活性是否与IRS1的这个位点磷酸化相关还不清楚，具体作用机制还有待研究。
值得注意的是，本研究结果只是在一种人源肝癌细胞株HepG2中，发现抑制JNK活性可负向调控胰岛素信号转导。这与以前报道的结论有所不同，即JNK活性的激活可导致胰岛素抵抗；而抑制JNK活性则可提高胰岛素信号转导，进而提高胰岛素敏感性。造成这种差异的原因可能是由于不同生理状态所致。例如，本研究是在正常生理状态下，发现抑制JNK活性可抑制胰岛素信号转导。而以前的研究多集中于在某种病理状态下，发现激活JNK活性可削弱胰岛素信号通路。如利用肿瘤坏死因子(TNFα)处理小鼠可激活小鼠肝脏组织JNK的活性，导致胰岛素抵抗[12]；或利用游离脂肪酸处理脂肪细胞也可激活JNK导致胰岛素转导的降低[13]；白介素6(IL-6)是一种促炎症因子，研究发现利用IL-6处理3T3-L1分化的脂肪细胞可显著降低胰岛素信号的传递，其分子机制也是通过提高JNK活性实现的[14]。另外，有关抑制JNK活性提高胰岛素敏感性的研究也是在糖尿病小鼠中发现的。例如，利用一种细胞通透性的、可抑制JNK活性的多肽处理2型糖尿病小鼠，发现该多肽可抑制JNK活性，从而提高胰岛素敏感性[15]。但是，与上述研究结果不同的是，有研究发现在肌肉细胞中，TNFα诱导胰岛素抵抗是通过激活p38 MAPK活性，而不是通过JNK信号通路实现的[16]。综上所述，本研究发现的抑制JNK活性导致胰岛素转导下降的结论是在正常生理状态下、从一种人源肝癌细胞HepG2中得到的。而以前研究结果，即激活JNK导致胰岛素转导的下降，是在某种病理状态下得出的结论。当然，不同器官组织中JKN活性对胰岛素转导可能也有不同反应。有关JNK对胰岛素信号通路的确切调控作用还有待进一步深入研究。
研究并探讨JNK活性对胰岛素信号传递的影响。
用不同种类的JNK抑制剂处理人肝癌细胞株(HepG2)细胞12 h，随后加入10 nmol/L胰岛素孵育5 min以激活细胞胰岛素信号通路，收集细胞蛋白样品用Western印迹方法检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及胰岛素信号通路分子蛋白表达情况。
JNK抑制剂(JNKi-Ⅷ)可有效抑制HepG2细胞中JNK的活性，并且JNKi-Ⅷ可浓度依赖性地抑制胰岛素信号传递。与JNK-Ⅷ类似，其他JNK抑制剂(JNKi-Ⅴ、JNKi-Ⅲ和SP600125)均可抑制HepG2细胞中的胰岛素信号通路。
在肝实质细胞HepG2中，抑制JNK活性可阻断胰岛素信号通路。