Allgrove综合征患儿AAAS基因突变研究
2018年1月
中华内分泌代谢杂志，第34卷第1期 第44页-第49页
王卡娜,丁静超,方燕兰,梁黎,王春林
Allgrove综合征是一种内分泌、胃肠道、眼睛及神经等多系统受累的疾病，临床上以无泪症、喷门失迟缓症、促肾上腺皮质激素抵抗性肾上腺皮质功能不全、神经系统损害等四联征为特征性表现。由Allgrove等[1]于1978年首次报道，至今欧洲、北美、北非、澳洲、亚洲等地区已相继报道，约150多例[2]。其中通过PubMed检索到日本8例，印度12例，中国5例[3,4,5]。
Allgrove综合征(OMIM 231550)呈常染色体隐性遗传，致病基因(AAAS基因，HGNC ID: 13666)位于常染色体12q13，编码ALADIN蛋白。该蛋白由546个氨基酸残基构成，包含4个WD重复蛋白特征性结构域，并借助跨膜蛋白NDC1锚定于控制细胞核质间物质转运的核孔蛋白(the nuclear pore complexes，NPCs)的胞质侧[6]。而WD重复蛋白位于NPCs的结构中，可调节NPCs亚结构域的组装，促进转运蛋白间以及其他多功能蛋白与NPCs间的相互作用。最近研究[7]表明，AAAS基因被敲除后，肾上腺皮质细胞及神经细胞容易氧化受损，同时类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory, StAR)及P450c11β蛋白表达减少。其中StAR是类固醇生成的限速调节蛋白，调节胆固醇转运通过线粒体膜。AAAS基因主要表达于肾上腺、垂体、小脑、消化系统(食管、胃、肝脏及胰腺)、胼胝体、胚胎肺[8]。ALADIN蛋白的广泛表达，致使Allgrove综合征临床表现呈多样性，多系统脏器受累。同时，该致病基因亦表现为基因突变异质性。迄今为止，HMGD数据库已记录75种AAAS基因突变，包括错义突变、无义突变、移码突变、剪切位点突变，在家谱中多呈现为纯合或复合杂合突变遗传模式。然而，临床上亦发现Allgrove综合征患者AAAS基因正常的报道[9,10]。近期，我们临床诊断1例Allgrove综合征先证者，对其家系AAAS基因进一步测序分析，现报道如下。
先证者于2015年3月在浙江大学医学院附属第一医院就诊过程中被确诊。先证者为14岁青春期女童，因反复皮肤色素沉着就诊。1岁时因"皮肤色素沉着，伴反复发热咳嗽半年"外院查肾上腺功能显示：皮质醇2.10 μg/dl、ACTH 1 250 pg/ml、17-羟孕酮1.09 nmol/L，电解质正常，诊断为"肾上腺皮质功能减退症"，一直给予氢化可的松片(剂量10~20 mg/m2)口服替代治疗。患者系第2胎第2产，足月顺产，出生体重4.1 kg，身长52 cm，无窒息史，混合喂养。生长发育略迟缓，4个月抬头稳，8个月独坐，1岁半时方可独立行走，近2岁学会单字发音，话音模糊不清。出生后一直无泪、说话鼻音、四肢肌力较正常同龄儿低。11岁时乳房开始发育，13岁半初潮至，周期、经期规则。家族史：一家4人，父母、姐姐(25岁)均未发病，父母非近亲结婚。家族中无类似病史。体格检查：身高158 cm，体重47 kg，体重指数(BMI)18.8 kg/m2，神经系统病理征阴性，说话鼻音，四肢肌力IV级，全身皮肤色素沉着，尤以各关节伸面皮肤褶皱处显著。经双眼Schirmer泪试验：5 min时0 mm，确诊为无泪症。双侧肾上腺CT检查未显示异常。
取Allgrove综合征先证者及父母亲外周抗凝血各5 ml，提取基因组DNA。针对AAAS基因DNA序列，使用FastPCR设计并合成特异引物，经PCR扩增该基因全部16个外显子及部分内含子序列。引物序列、片段长度及扩增区域见
在本次基因突变检测中，我们发现先证者AAAS基因第15号外显子序列图谱出现了叠峰，考虑存在杂合突变，运用亚克隆测序鉴定突变序列。设计第15号外显子引物(
运用在线软件Mutation Taster(http：//www.mutationtaster.org)预测AAAS基因突变的致病性，在常见的基因数据库(如1 000 G、ExAC)搜索报道已知AAAS基因突变位点的相关信息。同时运用Swiss Model(http：//swissmodel.expasy.org/)在线同源建模软件，采用通过简捷模式，分别对ALADIN蛋白及AAAS基因突变序列蛋白三级结构的同源建模，初步观察基因突变对该蛋白空间结构产生的影响。
根据患儿临床表现有ACTH抵抗性肾上腺皮质功能不全、无泪症，体格检查发现说话鼻音，四肢肌力IV级，全身皮肤色素沉着，双侧Schirmer测试阳性。临床诊断为Allgrove综合征。继续给予氢化可的松替代治疗，眼部保湿，防止角膜病变，间隔3~6个月随访，根据皮质醇、ACTH及临床表现，调整氢化可的松用法及剂量。
家系：先证者一家4人，父母、姐姐均无临床表现，仅对父母进行基因测序，先证者父母及其姐姐未做其他临床检测，父母非近亲结婚(
注：↗：先证者Proband；□：男性Male；○：女性Female; NN：AAAS基因检测正常Normal AAAS gene；NM：AAAS基因杂合突变AAAS gene heterozygous mutation；ND：未检测No detected; MM：AAAS基因纯合突变AAAS gene homozygous mutaion
该家系AAAS基因测序分别于第7、9、15外显子发现3个位点突变，即c.688C>T(p.Arg230X)、c.855C>T(p.Phe285Phe)、c.1347_1348insG(p.Gly450fsX495)。其中，先证者及其母亲携带c.688C>T杂合无义突变，先证者及其父母均有c.855C>T纯合同义突变，而唯有先证者在第15号外显子存在c.1347-1348insG杂合插入移码突变(
注：先证者显示c.688C>T(p.Arg230X)杂合突变、c.855C>T(p.Phe285Phe)纯合突变和c.1347-1348insG(p.Gly450fsX495)杂合突变，其母亲显示c.688C>T(p.Arg230X)杂合突变、c.855C>T(p.Phe285Phe)纯合突变，其父亲仅显示c.855C>T(p.Phe285Phe)纯合突变The proband showed c.688C>T(p.Arg230X)heterozygous mutation, c.855C>T(p.Phe285Phe)homozygous mutation, and c.1347-1348insG(p.Gly450fsX495)heterozygous mutation. The proband′s mother showed c.688C>T(p.Arg230X)heterozygous mutation and c.855C>T(p.Phe285Phe)homozygous mutation. The proband′s father only showed c.855C>T(p.Phe285Phe)homozygous mutation
上海华大基因测序结果提示，先证者AAAS基因第15外显子确实发生杂合突变c.1347-1348insG(
对该3个位点突变进行功能预测，Mutation Taster评估c.855C>T突变的致病可能性为1.254×10－13。经检索ExAC人类外显子组整合数据库，c.855C>T突变位点的等位基因变异率为0.9745，在dbSNP数据库中搜索到该位点命名为rs1546808，提示为单核苷酸多态性。同时Mutation Taster评估c.688C>T、c.1347_1348insG变异的致病可能性均为1，经检索ExAC得知c.688C>T突变位点的等位基因变异率为2.472×10－5，而c.1347_1348insG变异未被检索到，提示这2个突变为影响蛋白质功能的致病性突变。Swiss-Model软件分别对ALADIN蛋白、c.688C>T突变序列蛋白、c.1347_1348insG突变序列蛋白进行三级结构预测(
在dbSNP、1000G、ExAC数据库中检索对c.688C>T、c.1347_1348insG变异位点的报道，发现仅在ExAC数据库中检索到c.688C>T已被报道3例杂合突变，但均无Allrove综合征的临床表现。而在上述数据库中均未检索到c.1347_1348insG位点变异。
Allgrove综合征为常染色体隐性遗传疾病，根据临床表现、突变基因功能评估、孟德尔遗传定律，分析先证者发生Allgrove综合征的致病基因为AAAS基因复合杂合突变(c.688C>T、c.1347_1348insG)，其中c.688C>T突变位点来源于母亲，而c.1347_1348insG变异为首次报道的新发突变。
Allgrove综合征临床上可表现为出生后即出现无泪症，10岁前出现肾上腺皮质功能不全，10~20岁逐渐出现喷门失迟缓症。幼儿时期，常因未能早期识别，出现低血糖或肾上腺皮质功能危象而突然死亡。但是近些年，晚发或成人发病案例报道逐渐增多。与上述典型临床表现相比，晚发病例均以喷门失迟缓症为首发表现，平均28.4岁出现神经系统受累，尽管无泪症出生时即有，但以非症状性的表现存在，直至对疑似患者进行相关医学测定后方被诊断[11]。本报道案例与Allgrove综合征典型临床表现基本相符，出生即出现无泪症，婴幼儿期诊断肾上腺皮质功能减退症，但对本病认识不足，导致长期误诊。
儿童原发性肾上腺皮质功能减退症的主要遗传性病因还包括，肾上腺脑白质发育不良(adrenoleukodystrophy, ALD)和肾上腺脊髓神经病(adrenomyeloneuropathy, AMN)、先天性肾上腺发育不良(adrenal hypoplasia congenita, AHC)、自身免疫性多腺体综合征1型(autoimmune polyglandular syndrome type 1, APS1)、先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia, CAH)、先天性类脂性肾上腺增生症(Lipoid CAH)、家族性糖皮质激素缺乏症(familial glucocorticoid deficiency, FGD)等。其中，ALD或AMN、AHC临床除了表现为肾上腺皮质功能减退症，还累及神经系统，这与Allgrove综合征临床表型相似。ALD于婴儿期或儿童期以无力和痉挛起病，并迅速进展为痴呆、失明和四肢轻瘫[12]，肾上腺皮质功能减退症可能是ALD的唯一征象。AMD于青春期或成年早期以无力、痉挛和远端多神经病起病，但此病较轻且进展缓慢。神经系统病变症状可能早于肾上腺皮质功能减退症而出现，但可高达60%的ALD青少年男性患者和年轻成年男性患者在诊断肾上腺皮质功能减退症时没有或仅有很少的神经系统异常[13]。尽管原发性肾上腺皮质功能减退症的致病基因、发病机制、临床表型、疾病进程及严重程度有所区别，但由于其临床症状不典型性，故早期明确诊断仍较困难。因此重视原发性肾上腺皮质功能减退症的鉴别诊断，并进一步进行致病基因测序与分析，有助于阐明疾病发病机制，及早采用相应诊疗方案及预后评估。
ALADIN蛋白是一类新的属于色氨酸-天冬氨酸重复的超家族的调节蛋白，在肾上腺细胞中调节氧化还原平衡、抑制类固醇生成中起重要作用[14]。国内外已有较多该基因突变的报道[3,15,16]。该先证者基因分析显示为复合杂合突变(c.688C>T，c.1347_1348insG)，为国内外首次报道。一条等位基因在7号外显子发生点突变，第688位碱基胞嘧啶被胸腺嘧啶替换，造成蛋白无义突变p.Arg230X，使原为546个氨基酸的ALADIN蛋白截断为229个氨基酸，造成3个WD重复蛋白、微体目标信号等重要结构缺失。同时另一条等位基因在15号外显子发生碱基插入，第1348位碱基位置插入鸟嘌呤，造成蛋白移码突变p.Gly450fsX495，氨基酸序列从第450位开始发生改变，并于第1483位碱基提前出现终止密码，最后编码494个氨基酸残基(较ALADIN蛋白缺失52个氨基酸)，致使特征性结构缺损(如丝氨酸磷酸化修饰，微体目标信号)，造成蛋白功能发生改变。该先证者发生的复合杂合突变，使得ALADIN蛋白结构改变，影响NPC细胞核内外的物质转运，具有强致病性。此突变符合隐性遗传模式，与Allgrove综合征致病相关。
在AAAS基因的16个外显子中，除了3号外显子，其余均被证实过存在变异[3]。此外，在内含子4、5、7、11、14中也存在致病性基因突变。尽管尚未发现占据主导地位的特定性热点突变，但在某些位点的突变频率相对较高，如1号外显子(c.43C>A，p.Q15K)、8号外显子(c.787T>C，p.S263P)和内含子14(IVS 14+1G>A)[3]。其中超过20个家系的基因突变存在于1、8号外显子上，不存在明显的区域差异[3]。中国已报道5例，其中2例为复合杂合突变，3例为纯合突变，分别在外显子7、8、11、15上[3,4,5]。日本已报道8例，均为纯合突变，主要分布在外显子4、7、8、16及内含子7[2,17,18,19,20,21]。而本研究新发现的复合杂合突变涉及外显子7及15，为AAAS基因突变谱增添了新的突变，丰富了Allgrove综合征的基因异质性与临床表型的多样化。
总之，AAAS基因突变可以引起较为广泛的临床表现，诊断困难，应尽早开展相关基因检测，明确致病基因，从而为疾病的诊断与防治，为家系中相关个体产前诊断提供依据，从而有效减少患儿的出生，降低疾病的发生率。
[1] Allgrove J, Clayden GS, Grant DB, et al. Familial glucocorticoid deficiency with achalasia of the cardia and deficient tear production[J]. Lancet, 1978，1(8077):1284-1286.
[2] Ikeda M, Hirano M, Shinoda K, et al. Triple A syndrome in Japan[J]. Muscle Nerve, 2013，48(3):381-386.
[3] Li W, Gong C, Qi Z, et al. Identification of AAAS gene mutation in Allgrove syndrome: A report of three cases[J]. Exp Ther Med, 2015，10(4):1277-1282.
[4] Yang H, Zhang H, Lu L, et al. Clinical and genetic characterization of a Chinese patient with triple A syndrome and novel compound heterozygous mutations in the AAAS gene[J]. J Pediatr Endocrinol Metab, 2013，26(3-4):389-391.
[5] Lam YY, Lo IF, Shek CC, et al. Triple-A syndrome--the first Chinese patient with novel mutations in the AAAS gene[J]. J Pediatr Endocrinol Metab, 2006，19(5):765-770.
[6] Kind B, Koehler K, Lorenz M, et al. The nuclear pore complex protein ALADIN is anchored via NDC1 but not via POM121 and GP210 in the nuclear envelope[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009，390(2):205-210.
[7] Prasad R, Metherell LA, Clark AJ, et al. Deficiency of ALADIN impairs redox homeostasis in human adrenal cells and inhibits steroidogenesis[J]. Endocrinology, 2013，154(9):3209-3218.
[8] Handschug K, Sperling S, Yoon SJ, et al. Triple A syndrome is caused by mutations in AAAS, a new WD-repeat protein gene[J]. Hum Mol Genet, 2001，10(3):283-290.
[9] Li X, Ji C, Gu J, etal. Molecular cloning and characterization of AAAS-V2，a novel splice variant of human AAAS[J].Mol Biol Rep, 2005，32(2):127-131.
[10] Lovrecic L, Pelet A, Peterlin B. Heterogeneity of the triple A syndrome and assessment of a case[J]. Genet Couns, 2006，17(2):191-195.
[11] Nakamura K, Yoshida K, Yoshinaga T, et al. Adult or late-onset triple A syndrome: case report and literature review[J]. J Neurol Sci, 2010，297(1-2):85-88.
[12] Moser HW, Raymond GV, Dubey P. Adrenoleukodystrophy: new approaches to a neurodegenerative disease[J]. JAMA, 2005，294(24):3131-3134.
[13] Sadeghi-Nejad A, Senior B. Adrenomyeloneuropathy presenting as Addison′s disease in childhood[J]. N Engl J Med, 1990，322(1):13-16.
[14] Prasad R, Metherell LA, Clark AJ, et al. Deficiency of ALADIN impairs redox homeostasis in human adrenal cells and inhibits steroidogenesis[J]. Endocrinology, 2013，154(9):3209-3218.
[15] Kallabi F, Ben RB, Baklouti S, et al. Splicing defects in the AAAS gene leading to both exon skipping and partial intron retention in a Tunisian patient with Allgrove Syndrome[J]. Horm Res Paediatr, 2016，86(2):90-93.
[16] Bustanji H, Sahar B, Huebner A, et al. Triple A syndrome with a novel indel mutation in the AAAS gene and delayed puberty[J]. J Pediatr Endocrinol Metab, 2015，28(7-8):933-936.
[17] Nakamura K, Yoshida K, Yoshinaga T, et al. Adult or late-onset triple A syndrome: case report and literature review[J]. J Neurol Sci, 2010，297(1-2):85-88.
[18] Ikemoto S, Sakurai K, Kuwashima N, et al. A case of Allgrove syndrome with a novel IVS7 +1 G>A mutation of the AAAS gene[J]. Clin Pediatr Endocrinol, 2012，21(1):11-13.
[19] Kinjo S, Takemoto M, Miyako K, et al. Two cases of Allgrove syndrome with mutations in the AAAS gene[J]. Endocr J, 2004，51(5):473-477.
[20] Hirano M, Furiya Y, Asai H, et al. ALADINI482S causes selective failure of nuclear protein import and hypersensitivity to oxidative stress in triple A syndrome[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006，103(7):2298-2303.
[21] Katsumata N, Hirose H, Kagami M, et al. Analysis of the AAAS gene in a Japanese patient with triple A syndrome[J]. Endocr J, 2002，49(1):49-53.
