液相色谱串联质谱技术定量检测的临床应用现状与挑战

质谱（mass spectrometry， MS）技术是一种重要的检测分析技术，通过将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同的离子拥有不同的质荷比（m/z）进行分离和检测目标离子或片段，然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量检测^［1］。色谱分析是一种对混合物进行分离的技术，根据相互作用类型的不同，色谱法又分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和亲和色谱法。在临床生物样本检测中，用的最多的为分配色谱法，即根据样品组分在固定相与流动相之间溶解度的差异来实现目标物的分离^［2］。液相色谱（liquid chromatography， LC）因其流动相为液体而得名，液相色谱-质谱仪（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）是将色谱的高效分离能力和质谱的高特异性、高灵敏度相结合的分离分析技术。同时，为了获得未知化合物的结构信息和增加分析的选择性，往往采用串联质谱法（质谱-质谱联用，MS/MS）。LC-MS/MS技术以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快的优势显示出巨大的生命力。LC-MS/MS技术可以分析气相色谱-质谱仪（gas chromatography-mass spectrometer， GS-MS）无法分析的极性、低挥发性或蛋白类样本，在临床中有更广泛的应用及前景。

一、LC-MS/MS技术在临床定量检测方面的应用

（一）在类固醇类激素定量检测方面的应用

类固醇激素是由胆固醇经一系列酶催化而来，主要由肾上腺、胎盘和生殖腺产生，根据其具体的功能可分为雄激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素等。类固醇激素的水平检测在临床上具有重要意义，可用于类固醇相关障碍性疾病、先天性肾上腺皮质增生症、肾上腺功能异常（如Cushing 综合征）的诊断、监测、治疗和研究等^{［3, 4］}。但类固醇激素具有结构类似物多，浓度水平低且跨度大等特点。比如雌二醇浓度跨度范围可以从 4 pmol/L到10 000 pmol/L^［5］，睾酮在妇女和儿童体内的水平只有成年男性的1/20，给临床检测带来了巨大挑战。目前临床类固醇类激素的定量方法多基于免疫测定的分析方法，最常用的方法为化学发光免疫分析法，该方法灵敏，可自动化分析，但特异性较差，常常受到嗜异性抗体的干扰，容易与其他类固醇激素及结构类似物发生交叉反应，造成检测结果的假阳性或假阴性。高特异性、高灵敏度和可同步检测多种目标分析物的特性使得LC-MS/MS技术在类固醇激素检测发挥着其他方法不可替代的作用。目前，LC-MS/MS技术已广泛应用于临床类固醇激素的检测，针对的临床样本有血清、血浆、干血片和微量末梢血等^［4，6］。

（二）在维生素定量检测方面的应用

维生素（vitamin， Vit）主要为脂溶性的维生素A、D、E、K和水溶性的B族及维生素C，其中维生素D的临床应用最多^{［7, 8］}，主要是监测营养状态。临床实验室检测维生素的方法主要为分光光度法，色谱法、荧光法，电化学发光法和ELISA法，基于不同原理的检测方法之间结果存在较大差异。LC-MS/MS技术具有高灵敏度和高特异性的特点，可同时测定25-OHD2，25-OHD3以及25-OHD3的差向异构体3-epi 25-OHD3，解决了传统免疫方法特异性低，易与自身抗体和特异抗体发生交叉反应的问题，提高了检测结果的准确性，被视为维生素D检测的“金标准”。其次还有报道基于LC-MS/MS法同步检测VitA、VitE、VitK和B族维生素等的方法^{［9, 10］}。LC-MS/MS技术相较于传统免疫方法检测变异度更少，可对不同基质中多种维生素进行准确、可靠的检测，对于更精准的评估人体维生素水平、诊断以及合理使用维生素补充制剂至关重要。

（三）在治疗药物浓度监测方面的应用

自动化免疫方法操作简便，经济，无需样本前处理，是很多临床实验室进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）的常规方法，但由于该方法无法区分结构类似物，尤其是无活性代谢物的干扰，常常导致假性结果，对临床诊疗产生很大误导。LC-MS/MS相较于免疫分析方法通量、灵敏度和特异性更高，且样本需要量很少，可用干血片采样^［11］，患者可在家中采样后邮寄样本，非常便利。LC-MS/MS技术在药物浓度监测方面的独到优势，正逐步替代免疫检测方法，成为临床实验室检测方法的首选。目前LC-MS/MS在TDM的应用几乎包括了所有需要监测的药物，如免疫抑制药物、精神类药物、抗肿瘤药物、抗真菌药物、核苷类抗病毒药、滥用药物、抗心律失常药物及一些代谢产物的同时检测等。Maublanc等^［12］用LC-MS/MS技术同时定性和定量检测头发中35种精神药物及其代谢产物；Lee等^［13］定量检测尿液中的血管舒张类药物；Berm等^［14］使用LC-MS/MS方法检测干血片中三环抗抑郁药物阿米替林、去甲替林、丙咪嗪、氯米帕明及其活性代谢物的浓度，用于血药浓度监测；Jang等^［15］同时测定唾液中25种苯二氮类和唑吡坦的检测；Kyle等^［16］同时检测脐带血浆中丁丙诺啡、诺丁丙诺啡、美沙酮和葡萄糖醛酸结合物；Bylda等^［17］使用LC-MS/MS同时定量测定血清中的地高辛，洋地黄毒苷及其代谢产物；Hee等^［18］用LC-MS/MS同时定量人血浆中一线抗结核药物异烟肼/类似物与衍生物，利福平/类似物与衍生物以及代谢物等。LC-MS/MS方法比免疫分析方法的灵活性更高，临床实验室可以根据自己需要建立相应的检测方法，在样本量较大时，LC-MS/MS的单个样本的检测成本更低，效益更高。

（四）在代谢小分子定量检测方面的应用

LC-MS/MS技术在生化代谢小分子的应用主要有尿素、肌酐、尿酸、葡萄糖等，由于这些代谢小分子血清/血浆浓度相对较高，生化分析仪作为常规检测仪器更具优势，LC-MS/MS方法主要用于临床实验室参考方法和参考物质的研制，如我室建立的尿素的参考方法^［19］，Zhang等^［20］建立的葡萄糖的参考方法等。此外LC-MS/MS技术用于各级胆汁酸（胆汁酸谱）的检测具有很大优势，可同步检测血清中21种初级和次级胆汁酸^［21］，对于新生儿肝内胆汁淤积症、胆道闭锁和坏死性小肠结肠炎以及妊娠期^［22］胆汁淤积的早期无创诊断具有很大优势。

（五）在参考方法建立和标准物质研制方面的应用

1997年国际物质的量咨询委员会将同位素稀释质谱、精密库伦、电位滴定、凝固点下降法和重量法原理定为一级（基准）测量原理，即具有绝对测量性质。其中ID-MS法是唯一一种微量、痕量和超痕量元素权威测量方法，其同时具有质谱分析的高度特异性和同位素稀释的高度精密性，且测量的动态范围宽，样本制备不需严格定量操作，测量值能够直接溯源到国际单位制物质的量基本单位“摩尔”。因此基于同位素稀释质谱原理的方法在生物和临床化学溯源研究中受到越来越多的重视，为临床检验中标准物质的研制提供了技术保障，是临床检验参考方法的最佳选择。在检验医学溯源联合委员会列表中，最早建立的参考方法均为ID-GC-MS方法，但GC-MS方法主要适用于挥发性成分的分析，样本检测需进行繁琐的衍生化过程，这必然会增加测量不确定度，因此近年公布的新参考方法中，ID-LC-MS/MS技术正逐渐取代ID-GC-MS。如2015年Mineva等^［23］建立的血清25-OH-VitD3和25-OH-VitD2候选参考方法；2016年Hawley等^［24］建立的血清皮质醇候选参考方法；2018—2020年广东省中医院检验医学部建立的游离雌三醇、17-羟孕酮、17β-雌二醇和尿素的候选参考方法^{［19， 25, 26, 27］}等，均基于ID-LC-MS/MS技术。

二、LC-MS/MS技术在临床管理方面存在的问题

（一）缺乏统一的参考区间和医学决定水平

由于检测原理的不同，质谱检测结果与临床生化/免疫检测结果间存在差异，同一项目的参考区间在不同检测方法间往往不具互通性，这就给临床诊疗带来困惑。此外，不同地域、种族、采样时间以及个体的不同生理周期等往往对激素/微量元素等的检测结果有很大影响^［28］，给统一的参考区间的建立带来困难。同时也为医学决定水平的制定和应用带来更大挑战。目前质谱方法大多未有权威参考区间的发布，也为其在临床的广泛应用造成阻碍。

（二）临床检测标准化困难

目前LC-MS/MS临床检验方法绝大多数是实验室自建方法，市场上缺乏相应的检测试剂盒，没有相应的质控品，检测结果难以溯源到参考方法或参考物质。临床质谱仪有不同的品牌厂家，同一品牌又有不同的型号，临床样本含量复杂且待测物必须先进行离子化，对于不同的分子应选择不同的电离方法，如化学电离、大气压化学电离、电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离等，同时不同品牌的质谱仪依赖于不同的质量分析检测原理，如三重四级杆、orbitrap、离子阱、傅里叶变换等，临床建立检测方法需要根据仪器特点设置优化不同的检测参数等，不同实验室使用的仪器、试剂、标准品等不同，建立的方法存在差异，给LC-MS/MS检测的标准化带来很大困难。

（三）运行维护成本高，自动化程度不高

质谱仪的价格昂贵，多为国外进口，且需配套的高效液相色谱仪，氮气（发生器）、不间断电源、样本前处理配套装置（离心机、氮吹仪、固相萃取装置、通风柜等），以及独立、抽风、合适室温和湿度的实验室空间，如果用于临床，尚需考虑仪器故障的影响，可能需要备份仪器，无疑又增大了实验室的成本。与目前比较成熟的全自动生化仪、全自动化学发光仪等检测平台相比，LC-MS/MS的自动化程度亟待提高，需要专门的技术人员及相关培训，熟悉方法开发、性能验证、样品处理及仪器日常维护等相关过程。限制了其在临床实验室的普及应用，需要在样品处理、色谱质谱分析、数据读取、结果报告等流程上进行深度整合，以全面提高LC-MS/MS在临床检验的竞争力。

（四）政策和指南性文件少

目前，LC-MS/MS技术在临床检验领域中应用的行业政策、标准指南等规范性文件较少，CLSI C62-A^［29］在C50-A^［30］文件基础上对LC-MS/MS技术在临床实验室中的应用、正确操作、方法建立和性能评价等给出了指导原则，但专业性较强，需要专业技术人员的解读。2017年由中华医学会检验分会和卫健委临床检验中心多位专家形成的指南和共识性文件《液相色谱-质谱临床应用建议》^［31］，对LC-MS技术在临床应用的基本要求和LC-MS方法的建立、验证和执行提供了基本指导原则，较为详细，可供临床实验室参考应用。

此外临床实验室检测设备如批量应用往往需要具备国家认可的相关证书，很多厂家的设备尚无证书，且该过程需时较长，LC-MS/MS检测设备目前还处于快速发展时期，有证书的设备往往不是最新的检测设备。同时，检验项目准入、收费定价等方面也缺乏相关规定^［32］，均制约了LC-MS/MS在临床实验室的应用。

三、LC-MS/MS定量检测技术在临床广泛应用面临的挑战

（一）实现自动化面临的挑战

1.样本前处理复杂：临床生物样本的组成成分往往比较复杂，如临床检验中常用的血清样本，含有蛋白质/多肽、糖类、脂类、核酸类、无机盐、氨基酸、激素类、维生素、有机酸以及微量元素等，质谱仪器的高灵敏度，需要对样本进行前处理，分离净化待测组分，去除干扰组分等。不同的样本类型，不同理化性质的分析物，以及含量高低（如健康成年女性血清中葡糖糖含量为g级别，而雌二醇含量则为pg级别）等需要选择不同的样本前处理方法，同时需要对样本前处理方法进行优化，包括萃取方式，萃取试剂（和/或不同萃取试剂比例），萃取时间等，有些被测物还需要经过衍生化，对衍生化条件又需优化和选择，样本前处理方式的复杂要求，可供使用商品化试剂盒较少，往往需要手工操作，给临床自动化检测带来困难。

2.色谱-质谱检测参数个性化：色谱-质谱仪针对不同的被测量需要单独优化和使用检测参数，如色谱柱品牌/类型、流动相种类、比例、流速和分离梯度等；质谱仪的碰撞电压、去簇电压、聚焦电压、摄入电压、碰撞能量、离子化温度以及雾化气、气帘气、碰撞气等，且不同品牌的质谱仪检测参数也存在很大差异。LC-MS/MS技术相较于生化/免疫分析方法尚需要手工操作，且要求批量分析，难以实现紧急样本的随机插入检测，且报告周期较长（至少需要1个工作日），无法满足临床样本量较少且需快速报告结果的项目需求。以上要求均限制了质谱检测的自动化发展，无法像生化流水线一样批量快速样本处理和检测。

（二）技术上面临的挑战

1.离子抑制：离子抑制（或离子增强）^［33］是LC-MS/MS技术特有的一种“基质效应”。质谱的检测对象为离子，因此样本中被测物均需转变为带电离子，被测物离子化程度越高、形成的离子数量越多，质谱检测到的物质就多。在检测被测物的过程中，若存在大量其他离子时，且液滴表面离子过于密集，样品中被测离子不能到达液滴表面，不能通过离子蒸发模式形成气相离子，样品信号强度响应随着其他离子浓度的增高而降低，即离子抑制。流动相中的添加剂（盐及离子对试剂）、杂质，样品中的盐类、药物、代谢物、蛋白质等均可能影响离子化效率，造成检测结果的不准确。临床样本的类型（血清、血浆、尿液、唾液等）和来源（患者、健康人、不同年龄、性别）往往比较复杂，样本之间可能存在不同的基质效应，因此在方法开发时必须重视和评价。不过随着内标同位素的应用，与检测物往往有着类似的性质，在信号响应足够的情况下，不会对定量检测结果产生很大的影响。如果被测物浓度很低，信号响应不足，则可以通过优化前处理提取条件、衍生化或者优化分离梯度等进行解决。另外质谱无法区分同分异构体，也需色谱进行分离。

2.天然同位素干扰和源内变构：在LC-MS/MS的应用中，稳定同位素内标通常具有与待测分析物完全相同的分子结构，在样本制备过程中添加内标，能显著提高待分析物定量准确性。稳定同位素内标通常应该包含3个或更多稳定同位素原子，否则待分析物含有的天然同位素峰会被计入内标的峰面积从而影响检测结果的准确性。同时在使用氘代内标时还应注意源内变构现象^［34］，其原因是氘标记的内标在离子化过程中可与分析物发生氢-氘交换，会使得结果假性升高。因此，可以尝试不同标记元素的内标，如¹⁵N¹³C等；还有一些结合型代谢物（如霉酚酸可形成葡萄糖醛酸或者硫酸代谢物）可在离子源离子化过程中裂解，干扰检测，造成假阳性，需色谱分离，消除影响^［35］。

3.在生物大分子检测领域应用存在的技术挑战：随着基因组学和蛋白组学的快速发展，越来越多的生物大分子标志物在疾病诊断中广泛应用。近年来，虽然LC-MS/MS技术在生物大分子领域如蛋白和多肽测定中也逐步应用，不断有新项目的检测方法见诸报道，如C-肽、胰岛素、HbA_1c、胱抑素C等^{［36, 37, 38］}，但仅限于科研，如为临床常规应用，尚需解决一些技术问题。首先，血清/血浆中蛋白种类达上万种，浓度分布跨度非常大，对于低丰度的蛋白检测存在较大困难，需要提高仪器检测的灵敏度和准确度或者使用相关的富集技术；其次，蛋白的分子量通常都比较大，超过LC-MS/MS分析的范围，因此在检测前需要酶解成合适质荷比的肽段定量，增加了样本前处理的复杂度和时间，同时酶解效率等带来很大误差，导致方法重复性较差；再次，蛋白内标和肽段内标以及整个处理流程的经济、时间、人员成本较高；以上均限制了LC-MS/MS技术对生物大分子检测的临床广泛应用。相信随着微量蛋白富集技术、样品自动化处理以及同位素内标的进一步发展，LC-MS/MS技术在蛋白定量上的临床应用会越来越多。

综上，虽然与免疫学方法相比，LC-MS/MS技术具有鲜明的特点和独特的优势，但也还存在自动化程度低、仪器复杂、对操作人员要求高等不足。但相信随着技术的进一步发展成熟和配套试剂盒的开发应用，这些技术瓶颈会被逐步解决，质谱定量技术会在临床中有更广泛的应用。

自20世纪90年代LC-MS/MS技术应用于临床实验室以来，其灵敏、特异、高通量的精准检测结果使得其在临床检验中快速发展，越来越广泛的应用于临床相关疾病诊断^［39］。目前该技术在（代谢）小分子领域的应用逐渐成熟，未来的发展方向是在生物大分子（蛋白/肽段和核酸等）精准定量方法的研发应用。虽然LC-MS/MS技术在临床中应用存在一些缺陷，但相关专家正在积极探索，将其向全自动生化流水线发展，并集成到LIS系统中。MS供应商也积极开发更多通用的试剂盒，以帮助减少不同实验室间采用该技术的障碍和可比性问题。建立基于LC-MS/MS方法的参考区间、建立标准化的测量程序、参加室间质量评价计划，研制互通性良好的参考物质，基于LC-MS/MS技术开发商业化的检测试剂盒，将有助于进一步改进LC-MS/MS方法在临床上的应用现状。基于LC-MS/MS技术的检测方法是临床医学诊断的重要组成部分，相信随着技术的进一步发展，必然会在临床检测中有更广泛的应用。