拉萨地区表观健康人群血清同型半胱氨酸水平分析和参考区间初步调查

心脑血管疾病是全球范围内死因排名前列的疾病之一，而西藏地区心脑血管疾病（特别是脑卒中）的发病率及其疾病负担水平均位于中国前列^［1］。该类患者死亡率高，病情容易反复，常合并多种并发症，严重时会合并致残截瘫等，患者生存质量低下。高同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）血症可致血管内皮损伤，与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，是心脑血管疾病的独立危险因素^［2］，越来越受临床医师和患者的重视。

血清HCY的水平与性别、年龄有关，同时也受到生活方式、环境条件、生理因素、种族和遗传等多因素的影响^{［3, 4］}。而居住在我国高海拔拉萨地区的藏族人群，其遗传、饮食习惯等与汉族人群存在明显差异，这些差异是否会影响HCY的水平尚未见到文献报道。

HCY的测定有高效液相色谱法、荧光偏振免疫分析法、酶联免疫分析法、循环酶法等，其中直接循环酶法因其成本相对低廉，操作简便，有较高的准确性和抗干扰性而成为目前临床实验室常用的方法，也为临床开展HCY的相关研究提供了方法学保障。现今在各临床医院使用或试剂厂家说明书中提供的HCY参考区间多是<15 μmol/L，是基于荧光偏振免疫分析法且数据来源于欧美人群^［5］。然而，国家卫生健康委临床检验中心组织的不同方法和试剂组之间HCY的参考区间及其来源存在着较大的差异^［6］。在我国平原地区汉族人群HCY参考区间研究中，循环酶法检测HCY的参考区间上限多在15~20 μmol/L之间^{［7, 8］}。不同人群，不同的检测方法均可能导致HCY的参考区间不同^［9］，而我国高原地区不同民族的表观健康人群HCY参考区间罕见文献报道。

本研究拟分析拉萨地区820名表观健康体检者血清HCY水平，探讨拉萨地区不同民族、性别、年龄、季节分组中HCY水平的差异，并在此基础上建立拉萨地区不同民族表观健康人群血清HCY的参考区间，为临床合理使用该指标，进一步为高原地区心脑血管疾病的防治提供科学依据。

对象与方法

一、对象

收集西藏自治区人民医院2018年1月至12月表观健康的体检人员资料，排除标准为：（1）既往史：明确糖尿病史、心脑血管疾病病史、静脉血栓病史、高血压病史、妊娠期妇女、营养不良、乙醇依赖症等精神类疾病；（2）B超等影像学表现异常；（3）体检前1周内服用叶酸或复合维生素等药物史；（4）血压：收缩压>140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），或舒张压>90 mmHg；（5）慢性高原红细胞增多症：血红蛋白（hemoglobin，Hb）男性≥200 g/L，Hb女性≥180 g/L；红细胞比容（hematocrit，HCT）男性≥65%，HCT女性≥60%；红细胞（red blood cell，RBC）男性≥6.5×10¹²/L，RBC女性≥6.0×10¹²/L；（6）贫血：Hb男性<120 g/L，Hb女性<110 g/L；RBC男性<4.3×10¹²/L，RBC女性<3.8×10¹²/L；（7）肝肾功能异常：谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）男性>50 U/L， ALT女性>40 U/L；肌酐（Creatinine，Cr）男性>97 μmol/L，Cr女性>73 μmol/L；尿素氮（blood Urea Nitrogen，BUN）男性>8.0 mmol/L，BUN女性>7.5 mmol/L；（8）高脂血症：总胆固醇（total cholesterol，TC）>5.2 mmol/L，甘油三酯（triglyceride，TG）>1.7 mmol/L；（9）空腹血糖>6.1 mmol/L；（10）溶血标本；（11）使用D/R法排除离群值。

共收集到2 437名HCY体检患者，藏族1 867名，汉族570名。按上述排除标准排除后，共纳入表观健康人820名，年龄18~78岁，其中男性513名，女性307名；藏族626名，汉族194名。将所有入选者分为18~39岁（共176名）、40~49岁（共384名）和≥50岁（共260名）3个年龄组。根据采血时间将所有入选者按照3—5月为春季（共256名），6—8月为夏季（共126名），9—11月为秋季（共173名），12—次年2月为冬季（共265名）分为4个季节组。

二、试剂和仪器

采用美国雅培公司C16000全自动生化分析仪以及配套的北京九强公司生产的金雅HCY检测试剂和校准品（批号：18-0731，有效期：2019/07/30）。检测原理是基于小分子捕获技术（small molecular trapping，SMT）的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶法（直接循环酶法），参照厂家说明书进行参数设置和校准。

三、样本检测和质量控制

采用康健5 ml促凝管，于清晨采集空腹受试者的全血，50 min内分离血清（1 200×g，离心10 min），并于3 h内完成检测。使用Bio-Rad公司室内质控品（货号：592和593，批号：66392和66393，有效期：2019/10/31）进行室内质量控制， 2018年实验室内变异系数分别为4.42%（10.57 μmol/L）和4.08%（4.10 μmol/L）。2018年度卫健委临床检验中心室间质评成绩合格。

四、统计学分析

采用Excel 2007建立数据库，采用SAS 9.4和SPSS 13.0进行统计学分析。依据美国临床与实验室标准协会（the clinical and laboratory standards institute，CLSI）C28 文件对试剂说明书上提供的参考区间进行小样本验证。因验证不通过，考虑建立参考区间。以P₉₅为HCY的参考区间上限，不设检测下限。连续变量进行正态性检验，非正态分布则使用对数转换成正态分布后进行统计。两组间年龄、体重指数（body Mass Index，BMI）、血糖、血脂、血压等连续变量比较使用t检验，分类变量比较采用卡方检验。以一般线性模型对HCY水平的影响因素进行分析。使用Nested ANOVA分析性别、年龄、民族、季节间的差异是否具有统计学意义，再通过Z检验分析临床应用中是否需要分组建立参考区间。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、研究对象一般资料的比较

除藏族人群的平均年龄略高于汉族以外，藏族和汉族人群在各年龄组分布、性别及血脂、身体质量指数、血糖、身体血压、季节分布上的差异均无统计学意义。结果详见表1。

二、不同民族、性别、年龄、季节血清HCY分布比较

经一般线性模型分析结果显示，校正混杂因素后，在不同年龄、性别、民族组之间血清HCY水平有差异，其中≥50岁人群高于18~39岁和40~49岁年龄组（P=0.01），但18~39岁和40~49岁年龄组之间差异无统计学意义；男性高于女性、藏族高于汉族（P均<0.001），而HCY水平在不同季节差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图1。

注：A为男性和女性HCY的比较；B为藏族和汉族HCY的比较； C为不同年龄组HCY的比较；D为不同季节HCY的比较

三、建立血清HCY参考区间时需要考虑的因素评估

Nested ANOVA分析结果显示血清HCY在不同年龄、民族、性别间的差异具有统计学意义，而不同季节间的差异没有统计学意义。Z检验确定建立HCY参考区间时需要考虑性别和民族，而不需要考虑年龄。Nested ANOVA和Z检验结果见表2。

四、不同人群血清HCY水平的参考区间

依据Nested ANOVA分析和Z检验的结果，建立HCY参考区间时应考虑民族和性别因素。虽然不同民族、性别、年龄的HCY水平有差异，但是依据Z检验的结果无需考虑年龄因素建立参考区间。不同民族、不同性别HCY的参考区间见表3。

讨论

HCY是甲硫氨酸（蛋氨酸）代谢过程的中间产物，HCY可自发氧化，形成超氧化物和过氧化氢，致内皮细胞损伤及低密度脂蛋白氧化、造成血管平滑肌持续性收缩。在一些原发性和继发性的疾病中，HCY维持在较高的水平，从而成为诱发心脑血管疾病因素之一。

本研究中，藏族和汉族人群之间血清HCY水平存在明显的差异，引起这一现象的原因可能包括遗传背景、生活方式、饮食习惯等。有研究认为饮食对HCY有着重要的影响^［10］。维生素B6、B12 和叶酸对维持低浓度血清HCY水平有着重要意义^［11］。藏族的饮食结构中以肉类、奶制品、油类等为主，鱼类、蔬菜、水果等偏少^{［12, 13］}，适度饮酒对HCY影响目前还有争议^［14］。因此饮食习惯、生活方式可能是藏族血清HCY显著高于汉族的因素之一。目前除饮食习惯等以外，遗传背景也是影响HCY水平的重要因素，Steluti等^［15］报道亚甲四氢叶酸还原酶C677T（MTHFR C677T）的基因多态性对HCY有着显著的影响，一些SNP位点的多态性对HCY水平也有着影响^［16］，在部分人群和研究中发现了新的基因和位点（CD2AP）以及新的机制（ALOX5基因途径）都显著影响HCY水平^{［17, 18］}，但目前只有在藏族高血压人群中发现MTHFR C677T基因发生突变的TT（纯合子）组与其HCY水平呈正相关^［19］，在藏族其他人群中与HCY水平有关的基因表达情况研究数据还不充分，有必要在今后的研究中不断完善。

刘毓刚等^［20］发现生活在高海拔地区上汉族的HCY水平显著升高，这是因为在高原低氧环境中时，内皮型一氧化氮合成酶表达增加，但是活性下降，导致一氧化氮水平下降。一氧化氮是一种重要的血管舒张因子^［21］，与HCY水平呈负相关^［22］。在适应高海拔低氧环境条件过程中，生物存在一定的自由基代谢紊乱^［23］。拉萨地区氧气含量一年四季为平原地区含量的60%~70%之间，最高的夏秋季节也不超过70%，推测低（缺）氧是高原地区血清HCY水平显著高于平原地区的主要原因之一。高佳等报道北京地区健康成人血清HCY水平（循环酶方法）中位数（M）为12.1 μmol/L，低于本研究中的血清HCY水平^［8］。

本研究中，我们发现拉萨地区表观健康人群中血清HCY的浓度与性别有关，这与平原地区的以往研究基本一致^［24］。男性和女性HCY水平不同的原因是多方面的。首先，男性与女性间的不同激素水平^［25］可能是影响因素之一，其次，男性与女性间叶酸、维生素B水平也有一定的差异^［26］。另外，有文献指出吸烟与HCY水平呈正相关^{［27, 28］}，这可能也是男性HCY水平显著高于女性的原因之一。

除民族和性别以外，一般线性回归和Nested ANOVA结果均显示年龄也是拉萨地区表观健康人群血清HCY水平的影响因素之一。50岁以上人群HCY水平高于50岁以下人群，但是在50岁以下人群中不同年龄组间HCY水平没有显著差异。这可能与老年人的激素水平和叶酸等营养物质的水平有关^{［24, 25］}。虽然50岁以上人群的HCY水平高于50岁以下人群，两年龄组之间血清HCY的差异仅为5.7%，Z检验结果也显示建立HCY参考区间时并不需要考虑年龄因素。本研究中50岁以上人群相对较少，这主要是因为受传统观念的影响，老年藏族人群并不愿意采血，另外长期居住拉萨老年汉族人群更少建立高海拔地区HCY参考区间时是否需要考虑年龄因素还需要进一步的探讨和研究。

本研究中，我们根据HCY水平的影响因素，建立了藏族男性、藏族女性、汉族男性、汉族女性的HCY参考区间，与以往研究中的参考区间研究结果均有不同^{［5， 8， 20， 29］}，Boushey等^［5］研究中参考区间上限为15 μmol/L，该研究使用的方法是免疫偏振法，该方法已很少使用，与目前实验室使用较多的循环酶法相比，存在一定的差异，因此不适用于循环酶法。与使用循环酶法的其他研究相比，我们建立的参考区间高于平原地区刘彤等^［29］的研究，这主要是源于人群的差异。但另外两个研究^{［8， 20］}中，HCY参考区间上限高达32.25 μmol/L和36.66 μmol/L，一方面是因为研究中选择了第97.5%百分位数作为参考区间上限，另外也可能与研究中排除标准没有充分考虑到影响HCY水平的因素有关。

藏族心血管等疾病人群的研究证明，海拔对于HCY还是有影响的^［30］，所以在健康藏族人中，有必要建立高海拔地区的参考区间，在高海拔长期生活的汉族HCY水平也高于平原地区汉族人群^［20］。现有指南中HCY决定值均来自于平原人群，而该指标在高原地区应用尚无明确的说明，另外HCY检测方法目前未标准化^［31］，这些都是亟待解决的问题。

本研究也存在着一定的局限性：（1）汉族入选者人数偏少，这主要是由于拉萨地区为少数民族聚集区，居住超过一年的汉族同胞相对较少，且部分移居较长时间的汉族同胞有不同程度的高原疾病，而另有部分汉族同胞选择在平原地区体检。（2）缺少18岁以下的病例标本，存在一定的局限性。（3）未对表观健康人群是否有甲硫氨酸合成酶、胱硫醚-β-合成酶等的基因突变进行筛查。