质谱分析在糖尿病肾病诊治中的研究进展

糖尿病的患病率已达到大流行水平，随着人口老龄化和生活方式西化，中国糖尿病患病率从1980年的0.67%迅速上升到2013年的10.4%^［1］。该病常引起大血管和/或微血管病理改变，从而增加心肌梗死、心力衰竭、卒中、肾功能衰竭和生存率降低的风险^［2］。糖尿病肾脏病是（diabetes kidney disease， DKD）是糖尿病严重的肾脏并发症，是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease， ESRD）的主要原因，严重危害生命健康^［3］，因此早期诊断和治疗至关重要。但现有的临床试验如尿白蛋白与肌酐比值既不敏感也不准确，需要开发更敏感和可靠的生物标记物来了解DKD潜在的细胞和分子机制，以促进早期有针对性的干预措施。

目前大多数DKD生物标记物的研究仍依赖于尿液和血液样本^［4］，肾脏疾病是由肾脏内的蛋白质实体、单个细胞、肾单位、组织和体液水平的改变所驱动^［5］，质谱分析法（mass spectrometry analysis， MS）可以检测DKD患者的血液、尿液、组织等标本的生物标志物，已成为研究热点，在早期诊断、致病机制、治疗效果及预后评价等方面具有重要意义^［6］。

一、常用质谱分析法介绍

MS已逐渐成为基因组学、蛋白质组学、代谢组学等领域的重要技术，既可以对脂类、核苷类等生物小分子进行检测分析，也可以用来测定蛋白质、多肽、多聚糖等大分子生物结构，从而获取被分析分子的生物功能信息^［6］。目前常用的质谱分析法包括：电子轰击质谱、化学电离质谱^［7］、快原子轰击质谱、电喷雾电离质谱^［8］、大气压化学电离质谱^［9］，基质辅助激光解吸电离质谱^［10］等。在生物医学相关代谢产物研究中，MS通常与液相色谱或气相色谱联用，即常见的液相色谱-质谱（liquid chromatography mass spectrometry， LC-MS） ^{［11, 12, 13, 14］}和气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry， GC-MS） ^{［15, 16］}，用于分析含量较低的代谢分子，实现定性与定量相结合，前者用于分离溶液中不易挥发的代谢产物，后者分离易挥发、非极性代谢产物。

二、尿液MS在DKD诊断方面的研究

尿液检测仍然是目前DKD的临床首选项目，需要更多检测指标提供早期、可靠的诊断和机制^［17］，近几年尿液标志物的检测有诸多进展（表1）。

尿白蛋白是目前用于了解微量蛋白尿发病和预后的关键生物标记物，Vitova等^［17］对糖尿病患者的晨尿蛋白经二维电泳沉淀和分离，选择蛋白质组分进行质谱鉴定，发现激肽原片段表达与微量蛋白（MA）高度相关，可作为诊断DKD的标志物。为提高尿白蛋白的检测纯度，Badgujar等^［11］从DKD患者尿液中分离纯化尿白蛋白，纯化后肽质量指纹图谱与已知人类序列肽（P02768）相匹配，可以用来早期诊断。尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin/creatinine ratio， ACR）和eGFR是目前常用的诊断指标，研究发现T2DM患者afamin、CD44抗原和溶酶体相关膜糖蛋白2的水平与二者均显著相关，进展到更严重DKD期或早期肾功能减退患者的尿Afa/Cre^［12］明显高于未进展到DKD的患者，有助于在大量蛋白尿或肾功能减退发生前预测T2DM肾病高危患者。

DKD的发病机制仍是关注热点，若能发现敏感标记物，将为临床治疗提供帮助。沈莹等^［13］采用LC-MS/MS测定尿儿茶酚胺（CA）的含量，包括肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺和总CA的含量，发现DKD患者尿儿茶酚胺含量低于非肾病患者，可能与DKD的发生发展有关。在肾小球滤过率（GFR）正常或升高的情况下，Looker等^［14］采用定量液相色谱-质谱法检测到1型糖尿病患者尿肌醇1， 3， 4， 5， 6-五磷酸二激酶（IPP2K）正常；高尿IPP2K/Cr与1型糖尿病患者基线时较轻的肾脏损害和5年以上肾脏结构的保存有关，可作为DKD进展的预测指标。Chen等^［18］采用非靶向LC-MS/MS技术，对健康人和非糖尿病性巨蛋白尿（macro）、2型糖尿病（T2DM）和T2DM+micro患者的尿液进行代谢组学分析，检测到黄原氨酸和N1-甲基鸟苷可用于预测T2DM肾病的发展。

氧化应激是DKD发生的重要机制，Wang等^［19］为探讨RNA氧化在DKD早期的作用，对不同年龄db/db小鼠（一种纯合子糖尿病小鼠，无生育能力）肾组织和尿液中鸟嘌呤核苷的氧化产物进行分析，发现DKD早期症状的db/db小鼠的尿和肾组织中8-oxo-7， 8-二氢鸟苷（8-oxoGuo）和8-oxo-7， 8-二氢脱氧鸟苷（8-oxodGuo）的含量均升高，且其氧化损伤范围比对照的db/m小鼠［杂合子小鼠，db/db小鼠引入misty（m）基因后产生］更广。重要的是，与db/m小鼠相比，db/db小鼠在4周时尿和肾组织中的8-oxoGuo水平高于8-oxodGuo。提示在疾病早期，RNA氧化比DNA氧化更为明显。RNA氧化可能为糖尿病肾病的发病机制提供新的线索，而尿8-oxoGuo可能是一种新的、无创的、易检测的DKD生物标志物。Shukla等^［20］发现高氧化应激诱导DKD大鼠靶细胞凋亡，表现为Bcl-2表达显著降低，Bax、Caspase-3和PARP-1表达增加。晚期糖基化终产物在氧化应激过程中形成，在糖尿病中增加。尿调节蛋白是一种具有肾脏保护作用的蛋白质，形成高分子量聚合物，与微泡和外体结合， DKD患者的糖化尿调节素（glcUMOD）^［21］浓度明显高于非糖尿病CKD患者，可作为DKD的生物标志物。

尿液MS检测在DKD早期诊断及发病机制方面取得了诸多进展，尤其是与传统临床检查相比，敏感性较高，但仍有待于进一步实验及临床验证。

三、DKD血液及组织MS研究

虽然上述尿液MS技术对DKD的诊断、机制方面有诸多研究，但大多数限于试验或动物研究，尚未在临床开展，血液MS检测虽然相对较少，但也进行了很多研究（表2）。

Shao等^［15］对DKD和非肾病患者的血清和尿液代谢产物采用气相色谱-质谱联用（GC-TOFMS）分析，共鉴定出61种血清代谢物和46种尿代谢物为DN的潜在标志物，认为以GC-TOFMS为基础的研究为DKD的发生和发展提供了可能的途径。DNA或RNA的表观遗传修饰可能与DKD的发生发展有关，血清修饰核苷^［22］、油酸、谷氨酸和鸟苷^［23］可能是DKD肾损伤的潜在生物标志物。还有研究人员发现肾损伤分子1（KIM-1）^［24］和临床常用的检测指标β2-微球蛋白（B2M）显示出最一致的效应，联合应用增加临床协变量，可独立改善T2DM患者的肾功能下降预测，超出目前常用的临床因素和eGFR的效果。

肾小管上皮细胞凋亡是肾小管间质纤维化及其他肾脏疾病致病性的重要特征，DKD肾小管中的白蛋白降解受损，导致白蛋白片段的水平随着肾损伤程度的增加而升高。Grove 等^［25］采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）发现DKD小鼠肾脏中几种白蛋白片段的相对丰度显著增加，碎片相对丰度与肾病程度呈正相关。HRD1是一种E3泛素连接酶，通过促进靶蛋白的泛素化和降解来调节细胞凋亡和增殖等重要过程，HRD1的底物是eIF2α^［26］，是内质网应激PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路中的关键蛋白。HRD1介导的eIF2α泛素化可保护肾小管上皮细胞免受HG和PA诱导的凋亡，为肾小管间质损伤的治疗及预防提供了新的上游靶点。

线粒体功能障碍是DKD重要的发病机制，但机制尚不清楚。Aluksanasuwan 等^［27］经串联质谱（nanoLC-ESI-ETD-MS/MS）鉴定，在正常葡萄糖、高糖暴露后，从肾小管细胞中分离出线粒体，发现线粒体蛋白的磷酸化和氧化在一定程度上与DKD肾小管细胞线粒体功能障碍有关。DKD线粒体复合物-1^［28］活性中度增强，是完全正常化的特异性线粒体复合物-1抑制剂鱼藤酮（ROT），ROT能有效减轻肾小球和肾小管损伤，提示肾脏线粒体活性的过度激活可能与代谢紊乱和早期DKD的发病机制有关。另外，肾脏线粒体能量代谢失调^［29］是对STZ诱导的T1DM的早期反应。许多代谢产物参与了线粒体和脂肪酸（FA）代谢^［30］，组织学证实线粒体和FA可作为预测DKD的联合生物标志物，但仍需广泛验证。

Meprin金属蛋白酶是哺乳动物细胞表面的含锌指结构的蛋白水解酶（Met-Zincin），在血管内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞表面广泛分布，研究发现它参与了DKD的病理生理过程，Meprin-β基因的单核苷酸多态性与土著印第安人Pima（一个DKD患病率极高的美洲土著民族）中的DKD有关，Gooding等^［4］对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病野生型和Meprin-β基因敲除小鼠的肾组织采用亲水作用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法进行分析，发现N-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺与肾脏损伤有关，其异构体4-PY和2-PY是过氧化物酶体增殖和炎症的标志，与肌酐清除和葡萄糖耐量相关；研究认为Meprin-β活性通过改变肾脏代谢平衡，有利于高水平的尿毒症毒素，如硫酸吲哚和N-甲基吡啶酮-羧酰胺，在一定程度上增强了糖尿病肾损伤。

除上述生物标记物及组织学研究外，基因组学研究也是DKD机制研究的热点，核碱基和核苷是生物体内必需的内源化合物，在生物体内具有多种功能。Du等^［16］采用亲水性相互作用-液相色谱-串联质谱法测定DKD大鼠血浆中19个碱基和核苷，发现血浆中胞嘧啶、黄嘌呤、胸腺嘧啶、腺苷、鸟苷、肌苷和8-羟基-2′-脱氧鸟苷水平存在显著差异，可为DKD潜在生物标志物。一项600名中国汉族人UNC13B基因^［10］多态性（SNP）位点分析发现，GGCCG单倍型与DKD风险增加显著相关。

与尿液检测不同，血液及组织学检查的获取相对困难，但特异性及敏感性较前者更高，在代谢组学、氧化应激、肾小管损伤、基因组学等方面，质谱分析可以很好的辅助诊断及机制研究。

四、MS在DKD治疗评价研究

MS在DKD的药物治疗机制及效果评价方面也有一些新研究（表3），主要从改善代谢和减轻蛋白尿方面着手治疗。一项基于超高效液相色谱-四极飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）研究发现，蜂胶活性成分咖啡酸苯乙酯（CAPE）^［31］对镉诱导的小鼠糖尿病肾病的有保护作用，与其抗氧化、抗炎和Nrf2激活作用有关，可能是一种有效的药物。通过UHPLC-MS分析发现，甘地胶囊（GDC）^［32］不仅降低尿白蛋白的排泄，而且提高肾小球滤过率（eGFR），通过恢复甘氨酸代谢失衡、色氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、嘌呤代谢、硝基甲苯降解、苯丙氨酸代谢、脂肪酸代谢、酪氨酸代谢和酪氨酸代谢，改善代谢异常胆汁酸代谢途径，对DKD具有肾脏保护作用，是一种很有前途的药物。阿特拉森坦可能阻止线粒体功能障碍的进展以治疗DKD^［33］，为治疗提供方向。减轻尿蛋白方面，依帕司他是多元醇途径中醛糖还原酶的抑制剂^［34］，基于气相色谱-质谱（GC/MS）的代谢组学平台分析血浆、肾皮质和尿液中的代谢物，发现该药可抑制多元醇途径，降低山梨醇的生成，能显著降低db/db小鼠的蛋白尿，减轻足细胞足突融合和间质纤维化，抑制肾脏细胞醛糖还原酶和调节多元醇途径，对DKD有保护作用。

无论是改善氧化应激、调节代谢、减轻炎症反应，还是减少蛋白尿方面，中医药在治疗DKD诊治方面也有诸多进展。改善氧化应激方面，保肾方（BSF）^［35］可以减轻DKD足细胞氧化应激和凋亡，其中一些活性成分具有抗氧化活性，能显著降低DKD患者的24 h尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮，增加肾蛋白表达，减轻氧化性细胞损伤，抑制Bcl-2家族相关足细胞凋亡；减少蛋白尿，保护足细胞免受损伤。黄芪异黄酮苷元^［36］能抑制高糖引起的系膜细胞增殖和细胞外基质积累，通过保护细胞内抗氧化酶活性，增强内源性抗氧化功能，降低高糖诱导的细胞氧化损伤水平；调节细胞抗氧化防御，改善高糖诱导的系膜细胞功能障碍。葛根水提物^［20］能显著提高抗氧化酶活性，抑制氧化应激和凋亡，从而抑制尿白蛋白的排泄。DW1029M是桑树根皮和葛根的植物提取物，LC-MS分析发现，1期临床研究^［37］未观察到与任何药物水平相关的严重不良事件或临床或统计上显著的不良事件。

改善DKD代谢、减轻蛋白尿方面，银杏叶提取物^［23］也具有抗DKD作用。基于UHPLC-Q-TOF MS联用的代谢组学方法，分析大鼠尿液内源性代谢物的变化，发现黄岑-桅子^［38］通过影响胆汁酸的合成与代谢、尿毒素代谢和能量代谢发挥治疗作用。传统中药牛蒡子可以减少蛋白尿，牛蒡子素（ATG）是主要成分^［39］，细胞黏附和炎症是ATG治疗的两个关键途径。因中药多是复合制剂，多数临床验证的有效方剂的有效成分仍待进一步分析，期待以后的更多研究。

因质谱分析的特点，药物研究（尤其中药研究）方面进展颇丰，针对DKD发病机制的各个方面都有针对性的研究，期待更多确切性的研究来指导临床治疗。

五、MS在DKD预后评价中的研究

长链非编码RNA^［40］ CYP4B1-PS1-001在体内外DKD早期显著下调，它过表达可抑制小鼠系膜细胞的增殖和纤维化，研究发现CYP4B1-PS1-001和核仁素可能是治疗DKD有前途的预后标志物和分子靶点^［41］。Vaisa等^［42］采用靶向质谱法，发现以墨西哥裔美国人为主的T2DM和蛋白尿性DKD患者中，尿液中几种补体和补体调节蛋白的丰度与ESRD的进展和死亡密切相关。尿蛋白组分CKD273有望预测进展性DKD。Currie等^［43］发现尿蛋白组分CKD273与T2DM和MA患者的死亡率相关。不难发现，预后评价中的诸多检验指标仍离临床有很多距离，仍需要更多研究验证。

MS在DKD的早期诊断、预后评价、治疗评估等研究大致分为两类：其一，致力于发掘DKD早期诊断及发病机制的标志物检测；其二，致力于DKD药物治疗机制及预后评价；与现有的临床常用检测相比，MS检测出的部分标志物显示更敏感，但很遗憾的是，大多数研究仅发现标志物，却鲜有进一步验证。如果能够这些研究基础上开发数据库，将发现的生物标志物进行汇总，且不断验证，那么MS将被广泛用于DKD的临床诊治工作。