SRD5A2基因变异致5α-还原酶2型缺乏症的临床和遗传学研究

5α-还原酶2型缺乏症(5 alpha-reductase type 2 deficiency, 5α-RD2)是性发育异常(disorders of sexual development, DSD)的主要类型之一，约占46，XY DSD的7%~25%^[1]。5α-RD2是由于5α-还原酶2型缺乏引起睾酮(testosterone, T)转化为双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)过程受阻。5α-还原酶2型由位于染色体2p23的SRD5A2基因编码，以NADPH为递氢体，将T转化为与雄激素受体结合能力更强、生物活性更高的DHT。胚胎发育时期，在缺乏DHT刺激的情况下，男性泌尿生殖结节形成阴蒂头和阴蒂海绵体，尿生殖嵴形成小阴唇，阴唇阴囊褶皱形成大阴唇^[2]，使46，XY的个体外生殖器出现不同程度的男性化不足，甚至女性化。本研究回顾分析3例5α-RD2女性患者，总结临床资料，应用染色体核型分析、全外显子测序(whole exome sequencing, WES)、生物信息学分析和蛋白质模型构建等方法，对患者进行遗传学检测，并文献复习，提高临床医生对本病的认识和诊治水平。

对象和方法

一、对象

以2021年1月至2022年8月郑州大学第一附属医院小儿外科、妇科、遗传科收治的3例5α-RD2患者为研究对象。本研究经郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准(KS-2018-KY-36)。患者监护人签署知情同意书。

二、方法

1．资料收集：

通过医院电子病历收集患者的一般情况、病史、实验室检查、影像学检查和手术记录等资料。每6个月进行1次电话随访，截至2022年10月。

2．外周血染色体核型分析：

0.5 mL肝素钠抗凝的外周血接种于5 mL RPMI 1640培养基(广州达晖生物技术股份有限公司)，37℃培养72 h，加入20 mg/L秋水仙碱，对分裂中期的细胞低渗和固定制备细胞悬液，G显带后核型分析。

3．WES技术：

EDTA抗凝的外周血2 mL，提取DNA后，用美国Illumina公司的文库制备试剂盒，对200 ng片段化的DNA进行文库构建。采用Illumina公司的NovaSeq 6000 PE150测序模式。FASTQ文件采用上海瀚垚生物医学亿解基因数据解读系统进行变异注释和解读。具体参见文献^[3]。

4．聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和Sanger测序：

根据Ensembl数据库中SRD5A2基因参考序列(GRCh37/hg19)，采用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)在线工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝Blast Home)设计引物(表1)。PCR扩增产物纯化后进行Sanger测序，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

5．生物信息学分析：

采用生物信息学在线预测软件(http：//varcards.biols.ac.cn/)，对新发现的SRD5A2基因变异进行致病性评估，包括碱基变异对蛋白质功能的影响、变异位点编码氨基酸的保守性分析等。使用Polymorphism Phenotyping v2软件对脊椎动物物种间蛋白保守性进行比对^[4]。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)颁布的遗传变异分类标准与指南，将变异分为5类：致病性变异、疑似致病性变异、临床意义未明、可能良性变异和良性变异^[5]。

6．蛋白质模型构建和突变体分析：

采用SWISS-MODEL对5α-还原酶2型进行同源建模^[6]。登录NCBI蛋白质序列数据库查找5α-还原酶2型的氨基酸序列(P31213)，以3-氧-5-α-甾体4-脱氢酶(PDB ID：7bw1.1.A)为模板进行氨基酸同源序列比对和模型构建。利用PyMoL 1.7.6软件对同源建模结构进行研究，评估Pro250Ala变异对人5α-还原酶2型蛋白质结构的影响。

结果

一、临床特征

3例患者出生后生殖器外观均为正常女性，以女性抚养。临床表型和实验室检查结果见表2。例3母亲配偶为无精子症，为"供精"辅助生殖受孕。3例患者均为足月产，无产伤窒息史。智力正常。父母体健，否认家族遗传病史。例1外阴如女孩外观，阴蒂肥大，周长3 cm，长度2 cm，尿道外口位置稍靠下，直径约2 mm，阴道口不可明视。例2阴毛呈倒三角形，未见阴道口，阴茎短小，左侧隐睾位于大阴唇内，右侧隐睾位于腹股沟内，推之可下降至同侧大阴唇内。例3阴毛呈倒三角，阴茎短小，阴囊发育欠佳，右侧睾丸位于阴囊内，左侧阴囊空虚，阴道口不可明视。影像学检查：例1超声示盆腔内未见子宫及附件声像，双侧隐睾并体积小，左肾中部低回声(肥大肾柱？)。MRI示盆腔内未见子宫结构；膀胱后方条状结构；左侧髂骨囊性异常信号。例2超声示盆腔内未及典型子宫及卵巢声像。盆腔MRI示阴道、子宫、双侧卵巢未见明确显示；双侧腹股沟区异常信号，考虑隐睾；阴茎结构可见；膀胱后下方异常信号，精囊腺？膀胱下方尿道周围可疑幼稚男性结构。例3超声示右侧睾丸及附睾大小形态正常；左侧睾丸位于腹股沟内，体积偏小。3例患者肺部DR、腹部、泌尿系和心脏超声均未见异常。血常规、尿常规、电解质、凝血功能、肝肾功能均未见明显异常。

二、染色体核型分析

3例患者结果均为46，XY男性核型。

三、WES和Sanger测序结果

例1检测到SRD5A2基因c.16C>T(p.Gln6Ter)和c.680G>A(p.Arg227Gln)变异(图1)，分别来自父亲和母亲。例2检测到c.16C>T(p.Gln6Ter)和c.748C>G(p.Pro250Ala)变异，分别来自母亲和父亲。例3检测到c.679C>T(p.Arg227Ter)和c.265C>T(p.His89Tyr)变异，后者遗传自母亲。

注：箭头示变异位点

四、生物信息学分析

SRD5A2基因Gln6Ter和Arg227Ter为无义变异，导致编码的氨基酸变为终止密码子，产生截断的蛋白或无义介导的mRNA降解。Arg227Gln和His89Tyr为错义变异。人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database, HGMD)已收录该4个变异和5α-RD2有关，为已知致病变异。Pro250Ala变异为错义变异，导致第250位氨基酸由脯氨酸变为丙氨酸，该变异在人群数据库如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)、基因组突变频率数据库(GnomAD)、外显子组整合数据库(ExAC)和千人基因组数据库中没有发现(致病性中等证据PM2)，为新发现的变异。该变异位于蛋白高度保守区(图2)，多种生物信息学软件预测可能影响蛋白功能(致病性支持证据PP3)和R227Q变异构成复合杂合(致病性中等证据PM3)，患者临床表型符合该病(致病性支持证据PP4)。根据ACMG指南，该变异评为疑似致病。

注：(A)多种生物信息学软件预测该变异可能对蛋白质功能产生有害影响；(B)受影响的第250位氨基酸在进化上高度保守

五、蛋白模型构建和P250A突变体分析

5α-还原酶2型无已知的蛋白晶体结构，与3-氧-5-α-甾体4-脱氢酶的氨基酸序列一致性为99.61%，符合SWISS-MODEL建模要求。5α-还原酶2型结构模型见图3，是一种含有254个氨基酸的蛋白质，具有N端睾酮结合域和C端NADPH结合域，具有6个α螺旋结构。P250A突变体影响蛋白质C端结构和C端电势，使之失去与NADPH的静电作用，影响与NADPH的结合。

注：(A)以3-氧-5-α-甾体4-脱氢酶(PDB ID：7bw1.1.A)为模板，由在线软件SWISS-MODEL进行蛋白质模型构建(序列一致性99.61%，整体模型质量评估GMQE得分0.92)；(B)和(C)分别为第250位氨基酸未变异和变异后的局部二级结构，由PyMoL软件绘制完成

六、性别认定、治疗和随访

3例患者均诊断为5α-RD2基因复合杂合变异导致的5α-RD2。经多学科会诊综合评估后，例1选择男性性别，例2选择女性性别，例3暂未明确选择性别，待高中毕业外出求学后，拟改变为男性。例1行腹腔镜下双侧睾丸下降固定术，口服"十一酸睾酮软胶囊"。睾丸组织活检示发育不良的生精小管(图4)。例2行睾丸切除术和阴道成形术，口服雌激素治疗。例3行左侧隐睾下降固定术和阴囊成形术，等待时机进一步治疗。

注：(A)左侧；(B)右侧；均示发育不良的生精小管，符合发育不良的睾丸组织

讨论

5α-RD2患者外生殖器表型包括正常的女性生殖器，阴蒂肥大，小阴茎，尿道下裂，隐睾，完全男性化^[7,8,9]。患者以女性抚养后，青春期出现原发闭经，乳房不发育，外生殖器男性化，第二性征男性化(如声音低沉等)。男性患者幼童期表现为尿道下裂，小阴茎和隐睾等男性化不足表现^[10]。研究报道，5α-RD2是中国人群尿道下裂的主要原因^[8,11,12,13]，临床表型为小阴茎/阴蒂肥大的占66.1%，尿道下裂占39.9%，隐睾占19.9%，几乎完全男性化的占7.0%，完全女性化的仅占4.0%^[10]。本研究报道了3例社会性别均为女性的46，XY DSD患者，最终基因诊断为5α-RD2。hCG激发试验后T/DHT比值明显升高，是诊断5α-RD2的可靠指征。5α-RD2具有显著的临床异质性，WES不仅可快速诊断该病，还可有效鉴别导致46，XY DSD的各种疾病，揭示病因、指导治疗。本研究组前期纳入9例46，XY DSD的女性患者，WES均检测到包括SRY、AR、NR5A1和LHCGR基因的致病性变异^[14]。因此，对于社会性别为女性的46，XY DSD患者，推荐直接进行WES检测。

SRD5A2基因全长4 519 bp，仅有5个外显子。在没有条件开展WES或高度怀疑5α-RD2时，可直接进行SRD5A2基因Sanger测序。SRD5A2基因变异主要位于第1和4外显子，Arg227Gln、Gln6Ter和Gly203Ser是中国人群的热点变异^{[8,13,15,16,17]}。本研究发现Pro250Ala新变异，丰富了SRD5A2基因变异数据库。值得注意的是，HGMD数据库还收录了SRD5A2基因第1、2号外显子缺失和整个基因的缺失变异^[18,19]。因此对于只检测到1个等位基因变异的，建议继续采用多重连接酶扩增反应技术检测，提高基因检测的诊断率。

5α-RD2患者的性别重新分配需在患者、监护人以及多学科医生共同探讨沟通后决定，尊重患者的性别认同和社会文化背景，利于外生殖器的手术操作，最大限度保留潜在生育能力。作为女孩抚养的患者，由于青春期出现明显的男性化和文化偏见等因素，明确诊断后，几乎有60%发生了性别变化，并导致严重的心理问题^[20]。因此，建议外生殖器异常的患者及早行染色体核型分析和基因检测，提供早期性别认定依据^[10]。结合5α-RD2患者的外生殖器男性化程度，目前学者们多主张按照男性抚养^[21]。决定以女性生活的患者，为避免青春期男性化造成的心理负担，性腺切除时机可提至青春期前，青春期用雌激素替代治疗，维持第二性征。阴道成形术可根据患者(或监护人)意见择期进行。决定以男性生活的患者，应在小青春期结束后口服T或局部涂抹DHT凝胶以促进外生殖器男性化。有文献报道在5α-RD2患者精液中检测到精子，但精子质量存在问题，通过辅助生殖技术可受孕^[22]。5α-RD2为常染色体隐性遗传病，患者在生育前，建议配偶进行SRD5A2基因筛查。5α-RD2患者父母一般为携带者，若有生育需求，建议在下一次怀孕后进行遗传咨询和产前诊断。

综上所述，外生殖器发育异常是5α-RD2的常见表型，hCG激发试验后T/DHT的比值明显升高，提示5α-RD2，可直接进行SRD5A2基因Sanger测序。5α-RD2具有显著的临床异质性，使用WES可对46，XY DSD相关疾病鉴别诊断。本研究还报道了Pro250Ala新变异，进行变异体结构分析，丰富了SRD5A2基因变异数据库。