随着全自动凝血检测技术及分析技术的不断发展，越来越多的凝血参数应运而生，这些参数丰富了凝血指标的信息，更有助于凝血相关疾病的临床监测。凝固曲线波形分析（clot waveform analysis CWA）是由使用凝固法透射光原理检测凝血酶原时间（prothrombin time， PT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time， APTT）等凝血指标的凝血分析仪所绘制的凝固曲线波形图。CWA参数可以获得整个凝血过程的更多信息^{［1, 2］}。1997年，Braun等^［3］首次提出利用光学透射率数据可以对APTT和PT检测结果进行扩展性解释，分析了血友病中CWA参数的变化。进而，更多的研究表明，CWA参数在血友病严重程度的分型^{［4, 5］}、凝血因子缺乏和凝血因子抑制物导致的凝血因子活性降低的鉴别^［6］以及凝血因子治疗的监测^［7］中具有一定的价值。CWA参数在凝血因子缺乏相关的出血性疾病中的应用值得进一步探讨，但PT、APTT、纤维蛋白原（fibrinogen activity， Fbg）、凝血酶时间（thrombin time， TT）的CWA参数的参考区间尚罕见报告。本实验对凝血4项CWA参数参考范围的建立及其临床应用进行研究。

125名表观健康人来自2019年8月至2020年1月北京协和医院健康体检中心，无肝肾功能异常疾病、无出血及血栓性疾病，无家族史，血常规、尿常规、肝功能、肾功能、凝血等常规实验室指标均正常，男性98名，女性27名，年龄19~69岁。北京协和医院同期明确诊断凝血因子缺乏的患者25例，包括2例凝血因子Ⅱ缺乏者、2例凝血因子Ⅴ缺乏者、3例凝血因子Ⅶ 缺乏者、18例凝血因子Ⅷ缺乏者。根据血浆中凝血因子Ⅷ活性减低的程度，将血友病分为重型（因子Ⅷ活性<1%），中间型（因子Ⅷ活性为1%~5%），轻型（因子Ⅷ活性为>5%， ≤40%）^［8］。本研究得到北京协和医院伦理委员会批准（ZS-1359）。

枸橼酸钠（109 mmol/L）抗凝新鲜静脉血标本，抗凝剂与标本比例为1︰9。在1 500×g下离心10 min，取上层血浆，在2 h内通过CS-5100全自动血凝分析仪完成PT、APTT、Fbg、TT检测，并记录CWA参数的变化。如不能及时检测，标本于-80 ℃分装冻存，冻存标本检测前于37 ℃水浴15 min快速复温。标本无溶血、凝固、乳糜等不合格现象，红细胞比容<55%。

Sysmex CS-5100全自动血凝分析仪及配套PT、APTT、Fbg、TT试剂来自日本Sysmex公司， 低、中、高3水平质控品来自美国伯乐公司。CWA是光学检测系统检测凝血4项过程，通过识别血栓形成过程透光率的变化得出的参数，图1为APTT凝固曲线及求阶导线，典型的APTT凝固曲线如图1A，“X”轴表示时间（s），“Y”轴表示透射光强度（%）。最高点代表0%，最低点代表100%。在0~100%，选择预先设定的终点（一般设定50%），并确定此终点下的凝血时间［CT（s）］，图1B为透射光强度的一阶导数，反映了每个时间点的凝血速度，|Min1|（dT/dt）为最大反应速度。图1C为透射光强度的二阶导数，反映了每个时间点的反应加速度，|Min2|（d²T/dt²）为最大凝血加速度、|Max2|（d²T/dt²）为最大凝血减速度。ACL TOP700全自动血凝分析仪及配套凝血因子检测试剂及质控品来自美国IL公司。本研究严格按照临床实验室凝血项目检测标准操作规程进行。

注：A为APTT 凝固曲线，B为透射光强度的一阶导数，C为透射光强度的二阶导数

应用SPSS 22.0软件对检测结果进行统计学分析，绘制每组数据的分布图，了解该组数据的分布特性，以Kolmogorov-Smimov 进行正态性检验，符合正态分布的指标可按x? ±2SD表示参考区间，在两组间的比较采用t检验。非正态分布的指标则用百分位数法确定P_2.5~P_97.5表示参考区间，两组间的比较采用非参数检验。以临床诊断为金标准，根据ROC曲线分析健康人跟凝血因子Ⅷ缺乏患者和轻型、中间型凝血因子Ⅷ缺乏患者APTT检测各参数预测的临界值。P<0.05为差异具有统计学意义。

男性和女性的凝血4项CWA参数数据以Kolmogorov-Smimov 进行正态性检验，符合正态分布，以x? ±2SD表示男性和女性凝血4项CWA参数参考区间，男性与女性凝血4项CWA参数数据经t检验，差异无统计学意义（P均>0.05），见表1。

125名表观健康人的PT、APTT、Fbg、TT的CWA参数数据以Kolmogorov-Smimov 进行正态性检验，符合正态分布，以x? ±2SD表示凝血4项参考区间，见表2。

7例凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ）缺乏导致PT延长病例中，2例凝血因子Ⅱ缺乏病例的PT延长，其CWA参数均没有明显异常，2例凝血因子Ⅴ缺乏病例随着凝血因子缺乏程度的增强PT延长，CWA参数均减低，3例凝血因子Ⅶ缺乏病例随着凝血因子缺乏程度的增强PT延长，CWA参数均减低。详见表3。

凝血因子Ⅷ缺乏患者随凝血因子Ⅷ活性的减低，APTT延长，CWA参数减低，中间型和重型的CWA参数变化明显减低。详见表4。

健康人跟凝血因子Ⅷ缺乏患者经ROC曲线分析，APTT检测时间的线下面积（area under curve AUC）为<0.001，在检测HA患者中无应用价值（AUC在0.5~1.0，AUC越接近1.0，检测方法真实性越高，<0.5时，则真实性最低，无应用价值）。|Min2|、|Max2|对于凝血因子Ⅷ缺乏患者诊断的敏感度高于|Min1|。约登指数（Youden index）是评价筛查试验真实性的方法，指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大，约登指数=敏感度+特异度-1。|Min1|（4.31）、|Min2|（0.67）、|Max2|（0.52）约登指数最大，详见表5。

轻型、中间型凝血因子Ⅷ缺乏患者经ROC曲线分析，APTT检测时间的线下面积（area under curve，AUC）为<0.001，在检测HA患者中无应用价值，|Min2|、|Max2|对于轻型、中间型凝血因子Ⅷ缺乏患者诊断的敏感度明显高于|Min1|，|Min1|（1.75）、|Min2|（0.39）、|Max2|（0.28）时约登指数最大，见表6。

目前采用光学法全自动血凝仪检测凝血4项的原理为比浊法，实验室报告均为数值（s）/纤维蛋白原活性结果，仅表示为固定某一点的结果，而不能反映凝血过程更多的信息。CWA可提供光学检测系统识别血栓形成过程的分析曲线，通过透光率或吸光率变化，提供凝固过程的信息，可提供多个定量参数。

PT 是外源性凝血系统的筛选指标，INR是PT衍生的计算参数。血浆中凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平减低可导致PT延长。本研究中患者6和患者7凝血因子Ⅶ活性相差较大，PT检测值仅差0.6 s，而|Min1|、|Min2|相差明显增大，因此，|Min1|和|Min2|有助于PT在凝血因子Ⅶ因子缺乏中的监测。|Min1|在凝血因子Ⅱ、Ⅶ缺乏患者中无明显变化，但在凝血因子Ⅴ缺乏患者中明显减低，因此，|Min1|可区分凝血因子Ⅴ缺乏与凝血因子（Ⅱ、Ⅶ）缺乏引起的PT延长。凝血因子Ⅶ 缺乏患者随凝血因子活性缺乏程度的加重CWA参数减低明显，但病例5的（凝血因子Ⅶ活性为0.42）|Min2|、|Max2|明显低于健康人，这提示，|Min2|、|Max2|有助于评估凝血因子Ⅶ的活性。实验室中凝血因子的检测并非每个实验室均可以进行，PT检测实验相对大众化，因此在同一患者中，明确诊断凝血因子Ⅴ缺乏患者中|Min1|、|Min2|、|Max2|及凝血因子Ⅶ缺乏患者中|Min2|、|Max2|的趋势性变化结合PT检测结果可以辅助预测凝血因子Ⅴ、Ⅶ的活性。因本研究相关凝血因子缺乏数据尚少，在后续研究中进一步补充验证。

APTT 是内源性凝血系统的筛选指标，血浆中凝血因子Ⅷ缺乏可导致APTT延长。在重型血友病患者中APTT延长，轻型血友病患者中APTT仅轻度延长或正常^［8］。本研究表明，|Min2|、|Max2|在中间型、重型凝血因子Ⅷ缺乏患者中明显减低，|Max2|在重型凝血因子Ⅷ缺乏患者中明显低于健康人和轻型、中间型凝血因子Ⅷ缺乏患者，这与Matsumoto等^［6］的结果一致，同时他们研究还表明|Max2|在因血友病抑制物存在造成极严重FⅧ缺乏（<2.5 IU/L）及严重FⅧ缺乏（2.5~5.0 IU/L）有鉴别意义。在血浆中狼疮抗凝物阳性（>1.2）、轻度血友病、中度血友病及获得性血友病时，|Min1|比健康人均减低，且可以将狼疮抗凝物阳性患者与轻度血友病、中度血友病及获得性血友病分开^［9］。本实验以临床诊断为金标准，经ROC曲线分析，APTT研究参数|Min1|（AUC=0.961）、|Min2|（AUC=0.996）、|Max2|（AUC=0.990）的真实性较高。|Min2|、|Max2|在健康人和轻型、中间型凝血因子Ⅷ缺乏患者中敏感度较高，但是特异度较低，因此在观察凝血因子Ⅷ缺乏患者中凝血因子活性水平时应同时结合APTT检测结果。同时有研究表明^{［4, 5］}，CWA参数在低水平FⅧ和FⅨ的情况下具有良好的可预测性，可反映血浆样本中存在的不同促凝和抗凝因子之间的平衡，比单独测定FⅧ：C更好地预测血友病患者的出血倾向。

Fbg即为凝血因子Ⅰ，是血液中含量最高的凝血因子，主要用于纤溶筛查^［10］。实验室常规光学法全自动血凝仪检测纤维蛋白原的原理为Cluass活性法，报告为纤维蛋白原的活性（Cluass法）结果，无法提供纤维蛋白原抗原含量的测定结果，而鉴别纤维蛋白原异常为质的异常还是量的异常，对临床诊断及治疗监测更具指导意义。研究表明，最大凝血速度Min1水平与纤维蛋白原抗原含量的相关性最强，纤维蛋白原的Min1可区分异常纤维蛋白原的Ⅰ型（定量缺陷）和Ⅱ型（定性缺陷），使用Clauss法检测纤维蛋白原浓度值与Min1的比值Ac/Min1，可鉴别单纯异常纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症或二者混合的低异纤维蛋白原血症^［11］。

TT是指在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固的时间。在共同凝血途径中，所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。在低（无）纤维蛋白原症，弥散性血管内凝血以及类肝素物质存在（如肝素治疗、系统性红斑狼疮和肝脏疾病等）时TT出现延长。有研究表明，因FGGArg301 （275）Cys突变引起的遗传性纤维蛋白原减低患者相对于健康人血浆TT 的CWA振幅和最大速度相等或更高，而获得性低纤维蛋白原减低患者相对于健康人CWA振幅较低，而这两种疾病的TT通常都是延长的^［12］。

凝血4项是出血性及血栓性疾病筛查的常规检验项目。本研究通过建立光学法自动凝血分析仪凝血4项CWA参数的参考范围，在凝血因子缺乏的病例中，PT、APTT检测结果结合其相应的CWA参数进行讨论，发现凝血4项CWA参数可为临床补充血液凝固过程更多的信息，从而提升了凝血4项的临床报告的指标价值。本研究存在一定的局限性，全自动血凝分析仪检测凝血4项与凝血因子活性为两台不同检测系统仪器，因本实验室常规凝血筛查项目（凝血4项）和凝血因子活性检测均参加美国病理学会及卫生部实验室室间质评，近一年结果均在控，保证了结果的准确性，因此在一定程度上减低了本实验室两台不同检测系统的全自动血凝分析仪检测结果对本文研究的影响。