糖尿病是一种多病因所致胰岛素分泌和（或）作用缺陷引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。其中，大量研究表明胰岛β细胞含量的减少是造成持续高血糖的主要原因[1,2,3]。因此，促进功能性β细胞增殖，抑制其凋亡成为延缓糖尿病发生发展的关键，也是开发糖尿病治疗药物的重要思路[4]。生长分化因子11（growth and differentiation factor 11,GDF-11），又称为骨形态发生蛋白11，在胚胎发育过程中起关键作用[5]。新近研究发现增加老龄小鼠循环中的GDF-11水平可以逆转增龄诱导的心肌肥大、神经系统功能衰退及骨骼肌功能损伤[6,7,8]。有研究表明，相较于同窝出生的野生型小鼠，敲除GDF-11基因的小鼠β细胞数量显著减少[9]。我们前期研究也发现GDF-11可改善糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱及胰岛β细胞功能衰竭[10]。临床研究方面，Adela等[11]发现印度糖尿病患者中血浆GDF-11水平显著降低。因此，我们推测GDF-11具有保护β细胞、改善高糖诱导的β细胞凋亡的作用。本研究旨在观察GDF-11对高糖诱导小鼠胰岛素瘤细胞系MIN6细胞凋亡的作用，并探讨可能的分子机制。
DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；人重组GDF-11蛋白（recombinant GDF-11，rGDF-11）购于美国Pepro Tech公司；SB431542和LY294002均购于美国Sigma公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）试剂盒购于美国BD公司；一抗：单克隆兔抗鼠Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、叉头转录因子1（forkhead box O1, FoxO1）、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、核糖体S6蛋白激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1, S6k1）、磷酸化S6k1（p-S6k1）、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3抗体，二抗：单克隆山羊抗兔IgG抗体（辣根过氧化物酶标记）均购于美国CST公司；小鼠β-肌动蛋白抗体购于武汉博士德生物公司。MIN6细胞由武汉大学基础医学院汪长华教授惠赠。
MIN6细胞复苏后，采用DMEM基础培养基（含25 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青/链霉素），在37 ℃，5% CO2条件下常规培养。当细胞的密度达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，按1∶3进行传代培养。取对数生长期细胞用于实验研究。高糖诱导损伤模型的构建：MIN6细胞先用5.5 mmol/L葡萄糖浓度培养24 h后，再用不同浓度葡萄糖培养72 h，具体处理方法见文献[12]。
实验1，GDF-11对高糖诱导的MIN6细胞凋亡的影响：MIN6细胞加或不加转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）Ⅰ型受体抑制剂SB431542、PI3K抑制剂LY294002预培养30 min，rGDF-11预培养24 h后,分为下述5组：（1）正常对照组（NG，5.5 mmol/L葡萄糖）；（2）高糖组（HG，25 mmol/L葡萄糖）；（3）HG+GDF-11组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11）；（4）HG+GDF-11+LY492002组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11+50 μmol/L LY294002）；（5）HG+GDF-11+SB431542组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11+10 μmol/L SB431542）。各组细胞培养72 h后，采用Annexin V-FITC/PI双标记检测细胞凋亡率，Western blotting检测细胞内Bcl-2、Bax以及Cleaved-caspase3蛋白表达水平。实验2，GDF-11对高糖诱导MIN6细胞损伤的机制研究：MIN6细胞加或不加SB431542预培养30 min，rGDF-11预培养24 h后，分为下述4组：（1）正常对照组（NG，5.5 mmol/L葡萄糖）；（2）高糖组（HG，25 mmol/L葡萄糖）；（3）HG+GDF-11组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11）；（4）HG+GDF-11+ SB431542组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11+10 μmol/L）。培养30 min后，免疫荧光染色法检测各组MIN6细胞p-Smad2、p-Smad3表达水平。MIN6细胞加或不加LY492002预培养30 min，rGDF-11预培养24 h后，分为下述5组：（1）NG组（5.5 mmol/L葡萄糖）；（2）NG+GDF-11组（5.5 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11）；（3）HG组（25 mmol/L葡萄糖）；（4）HG+GDF-11组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11）；（5）HG+GDF-11+LY492002组（25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L rGDF-11+50 μmol/L LY294002）。培养30 min后，Western blotting检测各组细胞Akt、P-Akt、FoxO1p-FoxO1、S6k1、p-S6k1蛋白水平。
取对数生长期，生长状态良好的MIN6细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板，每组设5个复孔，依照上述实验分组干预后收集细胞。将各样本细胞重悬于500 μl结合缓冲液，加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min。1 h内送流式细胞仪上机检测，用CELL Quest软件对结果散点图进行分析。
按上述分组干预MIN6细胞，培养结束后取出爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min；：磷酸缓冲液清洗3次，每次3 min；再用0.5% Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min；滴加5%山羊血清，室温封闭30 min；每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（p-Smad2或p-Smad3,稀释比例均为1∶400）并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；隔天滴加稀释好的荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG，湿盒中20~37 ℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，DAPI染核；用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察采集图像。Image J软件分析荧光图片。
收集处理好的MIN6细胞，加入裂解液提取总蛋白，用Bradford法测定样品蛋白浓度，各组取40 μg蛋白上样于12%的聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳完成后转印到聚偏二氟乙烯膜转膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，依次加入相应特异性一抗(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1、S6k1、p-S6k1均为1∶1 000；β-actin 1∶200)和辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例为1∶50 000）处理，最后使用化学发光显色曝光，BandScan分析胶片灰度值。
采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以
±s表示。多组间比较选用单因素方差分析,组间多重比较用最小显著差异t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
为了探讨GDF-11对高糖诱导MIN6细胞凋亡的作用，我们通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，结果如图1所示。与NG组相比，HG组MIN6细胞凋亡率明显升高（P<0.01），但rGDF-11预处理后细胞凋亡率明显低于HG组（P<0.01），差异具有统计学意义；而SB431542或LY294002能部分消除rGDF-11对β细胞的保护作用，其细胞凋亡率较HG组稍低（均P<0.05），但明显高于rGDF-11组（均P<0.05），差异也有统计学意义（表1和图1）。
 | 表1 各组MIN6细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达水平的比较（ |
各组MIN6细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达水平的比较（
±s）
| 组别 | 凋亡率（%） | Bcl-2/β-actin | Bax/β-actin | Bcl-2/Bax | Cleaved-caspase3/β-actin |
|---|---|---|---|---|---|
| NG | 7.9±0.8 | 0.82±0.11 | 0.20±0.03 | 3.82±0.26 | 0.17±0.02 |
| HG | 26.1±3.0 | 0.33±0.05 | 0.81±0.11 | 0.39±0.03 | 0.83±0.04 |
| HG+GDF-11 | 11.1±2.6 | 0.73±0.07 | 0.31±0.02 | 2.28±0.07 | 0.33±0.03 |
| HG+GDF-11+LY294002 | 16.4±3.0 | 0.62±0.03 | 0.58±0.02 | 1.08±0.08 | 0.52±0.01 |
| HG+GDF-11+SB431542 | 21.6±2.6 | 0.52±0.01 | 0.75±0.08 | 0.70±0.06 | 0.61±0.05 |
| F值 | 26.10 | 369.85 | 11.48 | 56.27 | 208.61 |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：NG：正糖组；HG：高糖组；GDF-11：生长分化因子11；HG+GDF-11：高糖+GDF-11组；HG+GDF-11+LY294002组：高糖+GDF-11+磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂组；HG+GDF-11+SB431542组：高糖+GDF-11+转化生长因子β受体抑制剂组；Bcl-2：B淋巴细胞瘤2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；Cleaved-caspase 3：活性半胱天冬酶3；β-actin：β肌动蛋白
注：NG：正糖对照组；HG：高糖组；GDF-11：生长分化因子11；LY294002：磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002组；SB431542组：转化生长因子β受体Ⅰ抑制剂SB431542组
为进一步验证GDF-11减少MIN6细胞凋亡的作用，我们用Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白表达。从图2可以看出，与NG组相比，HG组促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，Bcl-2/Bax比例下降，从而增加Cleaved-caspase3表达（均P<0.01）。但是，重组GDF-11蛋白干预后可下调Bax表达，上调Bcl-2表达，增加Bcl-2/Bax比例，减少Cleaved-caspase3表达（均P<0.01）。而SB431542或LY294002与MIN6细胞共培养后rGDF-11的抗凋亡作用均明显减弱（均P<0.05）（表1和图2）。
注：1：正糖对照组；2：高糖组；3：生长分化因子11组；4：磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002组；5：转化生长因子β受体Ⅰ抑制剂SB431542组；Bcl-2：B淋巴细胞瘤2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；Cleaved-caspase 3：活性半胱天冬酶3；β-actin：β肌动蛋白
免疫荧光检测细胞Smad信号表达情况，如图3所示，与NG组相比，HG组p-Smad2水平（荧光强度表示）显著降低（0.52±0.01比1.09±0.18，t=4.83，P<0.01）、p-Smad3水平明显升高（1.03±0.14比0.43±0.11，t=5.76，P<0.01）。与HG组相比，rGDF-11预处理后可恢复细胞内p-Smad2水平（1.26±0.21比0.52±0.01，t=5.55，P<0.01），但对p-Smad3水平无明显作用（0.95±0.25比1.03±0.14，t=0.441，P>0.05），而SB431542明显抑制rGDF-11介导的MIN6细胞p-Smad2蛋白表达的增加（0.92±0.16比1.26±0.21，t=3.04，P<0.05）（图3）。
注：NG：正糖对照组；HG：高糖组；HG+GDF-11：高糖+生长分化因子11组；HG+GDF-11+ SB431542：高糖+生长分化因子11+转化生长因子受体Ⅰ抑制剂SB431542组
如图4所示，高糖明显减少p-Akt、p-S6k1、p-FoxO1水平（均P<0.01），而rGDF-11预处理后p-Akt、p-FoxO1水平明显高于HG组（均P<0.01），但对p-S6k1无明显影响（P>0.05）。加入LY492002则显著抑制rGDF-11介导的细胞内p-Akt、p-FoxO1蛋白表达的增加（均P<0.05）（表2和图4）。
 | 表2 各组MIN6细胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、p-S6k1/S6k1相对量比较（ |
各组MIN6细胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、p-S6k1/S6k1相对量比较（
±s）
| 组别 | p-Akt/Akt | p-FoxO1/FoxO1 | p-S6k1/S6k1 |
|---|---|---|---|
| NG | 0.44±0.01 | 0.43±0.04 | 0.38±0.01 |
| NG+GDF-11 | 0.64±0.06 | 0.61±0.04 | 0.37±0.02 |
| HG | 0.26±0.03 | 0.25±0.06 | 0.19±0.02 |
| HG+GDF-11 | 0.46±0.01 | 0.49±0.03 | 0.20±0.02 |
| HG+GDF-11+LY294002 | 0.36±0.01 | 0.33±0.03 | 0.17±0.03 |
| F值 | 58.81 | 34.15 | 59.68 |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：NG：正糖对照组；HG：高糖组；GDF-11：生长分化因子11；LY294002组：磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂组；SB431542组：转化生长因子β受体Ⅰ抑制剂SB431542组；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；FoxO1：叉头转录因子1；p-FoxO1：磷酸化FoxO1；S6k1：核糖体S6蛋白激酶1；p-S6k1：磷酸化S6k1相关X蛋白
注：1：正糖对照组；2:正糖对照组+生长分化因子11 （GDF-11）组；3：高糖组；4：高糖+生长分化因子11组；5：高糖+生长分化因子11+磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002组；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；FoxO1：叉头转录因子1；p-FoxO1：磷酸化FoxO1；S6k1：核糖体S6蛋白激酶1；p-S6k1：磷酸化S6k1；β-actin：β肌动蛋白
随着经济发展和生活方式的改变，糖尿病在全球范围内严重危害人类健康。多项研究发现，糖尿病患者和动物模型胰岛β细胞凋亡率明显增高，但增生及复制正常，提示凋亡增加是β细胞数量减少的主要原因[13,14]。值得注意的是，糖尿病最主要的代谢紊乱是高血糖。大量临床和基础研究表明，慢性高血糖可抑制胰岛素转录激活因子的活性，诱导晚期糖基化终末产物等氧化应激产物的形成，影响凋亡相关基因的表达，进而促进胰岛β细胞的凋亡[15,16]。因此，如何更好地减少高糖诱导的β细胞凋亡，提高胰岛β细胞数量已成为当前研究的一大热点。研究发现，GDF-11不仅可以延缓多个器官的衰老进程，而且可以正向调控机体的代谢及胚胎发育中β细胞数量[5, 9]。本研究通过rGDF-11干预高糖诱导的MIN6细胞凋亡模型，首次证明GDF-11具有抗高糖诱导的MIN6细胞凋亡作用，其机制可能与激活TGF-β/Smad2及PI3K-Akt-FoxO1信号通路有关。
细胞凋亡受到多种促凋亡基因及抗凋亡基因的调控，其中Bcl-2家族在细胞凋亡研究中广受关注[17]。Bcl-2具有抗凋亡作用，Bax具有凋亡促进作用，Bcl-2/Bax比例上调能减少凋亡，比例下调则促进凋亡。Bcl-2失活可促进细胞色素C自线粒体释放至胞质，从而激活半胱天冬酶（Caspase），促进细胞凋亡[18,19]。本研究结果显示GDF-11可能通过恢复细胞内Bcl-2表达，减少Bax表达，使Bcl-2/Bax比例增加，下调凋亡关键酶Cleaved-caspase3表达，最终使细胞凋亡率降低。
我们进一步探讨了GDF-11对MIN6细胞保护作用的机制（图5）。GDF-11属于转化生长因β（TGF-β）超家族，可与Ⅱ类受体中的ActRⅡA或ActRⅡB结合，再磷酸化Ⅰ类受体中的ALK4、ALK5或ALK7，形成配体受体复合物再作用于胞浆内的Smad蛋白，活化的Smad蛋白再与Smad4一同被转运至胞核，与核内的辅助因子共同调控靶基因的转录、翻译及表达[20]。重要的是，早期研究发现Smad2+/-小鼠胰腺表型与GDF-11-/-胎鼠几乎一致，表明GDF-11可能通过Smad2通路调控胰腺发育[9]。我们的前期研究也发现GDF-11可能通过Smad通路抗高糖诱导的内皮细胞凋亡[21]。在本研究中，重组GDF-11蛋白干预后明显恢复Smad2磷酸化水平，但对Smad3磷酸化水平无明显影响，而加入TGF-β受体Ⅰ抑制剂SB431542后明显抑制Smad2活化作用。此外，SB431542显著削弱GDF-11抗高糖诱导的MIN6细胞凋亡作用。这些结果均提示GDF-11可能通过激活Smad2信号通路减少β细胞凋亡。
注：GDF-11：生长分化因子11；TGF-β receptor：TGF-β受体；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；Akt：蛋白激酶B；FoxO1：叉头转录因子1
另外，GDF-11也能激活一些非Smad信号途径，包括PI3K、Akt、ERK1/2、P38MAPK等信号通路[22]。而且，研究显示，Akt活性增高可促进FoxO1磷酸化，使FoxO1可从胞核转移至胞浆，进而抑制凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase3等表达，减少胰岛β细胞凋亡[23]。另外，S6k1，作为Akt信号通路重要的下游靶分子，也在β细胞的生长、存活、分化、增殖中扮演重要角色。研究表明，S6k1-/-小鼠β细胞数量显著减少而且血糖明显升高[24]。本研究发现，GDF-11可显著升高细胞内Akt及FoxO1磷酸化水平，但对S6k1的表达无明显影响，而PI3K抑制剂LY294002加入后可明显消除GDF-11的促Akt及FoxO1活化作用。另外，GDF-11介导的抗细胞凋亡作用可被LY294002明显削弱。因此，上述结果证明了GDF-11可能通过激活PI3K-Akt-FoxO1信号转导途径抑制细胞凋亡。
综上所述，本实验证实GDF-11可能通过激活TGF-β/Smad2及PI3K-Akt- FoxO1信号通路，从而减少促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3的表达，增高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，最终减少高糖诱导的β细胞凋亡。这说明GDF-11对高糖引起的胰岛β细胞凋亡的防治有重要意义。值得注意的是，本研究仅使用25 mmol/L葡萄糖浓度来诱导MIN6细胞损伤，我们仍需进一步探索高糖诱导MIN6细胞损伤模型的最佳葡萄糖浓度。另外，GDF-11对动物和人体糖尿病的作用仍需进一步研究。
探讨生长分化因子11（GDF-11）对高糖诱导的小鼠胰岛素瘤细胞系MIN6细胞凋亡的影响及可能机制。
在体外不同葡萄糖浓度下培养MIN6细胞，分别加入重组GDF-11蛋白（rGDF-11）、转化生长因子β(TGF-β)受体Ⅰ抑制剂SB431542及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002等干预因素。根据实验目的及干预因素不同将细胞随机分组为：正常对照组、正常对照组+GDF-11组、高糖组、高糖+GDF-11组、高糖+GDF-11+LY492002组、高糖+GDF-11+SB431542组。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率，Western blotting法检测细胞内B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、活性半胱天冬酶3（Cleaved-caspase3）等凋亡相关蛋白以及蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt（p-Akt）、叉头转录因子1（FoxO1）、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、核糖体S6蛋白激酶1（S6k1）、磷酸化S6k1（p-S6k1）水平。免疫荧光染色法检测MIN6细胞磷酸化Smad2（p-Smad2）、磷酸化Smad3（p-Smad3）表达水平。多组间比较选用单因素方差分析，组间多重比较用最小显著差异t检验。
高糖可明显降低Bcl-2/Bax比例，升高凋亡关键酶Cleaved-caspase3表达，细胞凋亡率增加（分别为0.39±0.03比3.82±0.26、0.83±0.04比0.17±0.02、26.1%±3.0%比7.9%±0.8%，t=23.12、-27.60、-10.11，均P<0.01）。而重组GDF-11蛋白干预可上调Bcl-2/Bax比例，减少Cleaved-caspase3表达，抑制细胞凋亡（t=-44.110、19.530、6.535，P<0.01）。SB431542或LY294002与MIN6细胞共培养后rGDF-11的抗凋亡作用均明显减弱（均P<0.05）。高糖显著降低p-Smad2水平（荧光强度表示），升高p-Smad3水平（t=4.830、5.760，均P<0.01）。rGDF-11预处理可恢复细胞内p-Smad2水平，而SB431542明显抑制rGDF-11诱导的MIN6细胞p-Smad2蛋白表达的增加（t=5.55、3.04，均P<0.05）。高糖可明显减少p-Akt、p-S6k1、p-FoxO1水平，而rGDF-11预处理后p-Akt、p-FoxO1水平明显高于HG组（均P<0.01）。加入LY492002后，显著抑制rGDF-11诱导的细胞内p-Akt、p-FoxO1蛋白表达的增加（均P<0.05）。
GDF-11可能通过激活TGF-β/Smad2及PI3K-Akt- FoxO1信号通路减少高糖诱导的β细胞凋亡。