EZH2基因与果蝇ZESTE基因增强子具有同源性，是Polycomb group（PcG）蛋白家族中的一员[1]。PcG蛋白家族参与组蛋白修饰，EZH2可以特异性地修饰组蛋白H3K27甲基化。近年来的研究表明，EZH2在膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤及肝细胞癌等多种肿瘤中表达上调[2,3]。动物实验显示，抑制癌细胞EZH2的活性，小鼠肿瘤形成受到阻碍[4]。为了明确EZH2对食管癌细胞的作用，本研究运用小RNA干扰技术，探讨沉默EZH2表达对食管癌细胞增殖凋亡及H3K27甲基化的作用。
人食管癌细胞KYSE150和人正常的食管上皮细胞HEEC购自于美国CTCC BIOSCIENCE公司；CO2培养箱、流式细胞仪均购自于美国Thermo公司；Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3、Act-H3、H3K27 me2、H3K27 me3、GAPDH单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自于美国CTS公司；胰蛋白酶和RPMI1640培养基均购自于美国Sigma公司；胎牛血清购自于杭州四季青公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自于碧云天公司。
（1）细胞培养：将人食管癌细胞KYSE150和人正常的食管上皮细胞HEEC加入含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，离心弃上清后放置于37℃、5% CO2培养箱中培养。观察细胞融合度超过90%时，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，离心弃上清，加入细胞培养液悬浮后，接种到细胞瓶中继续培养。（2）细胞转染：取处于对数生长期的人食管癌细胞KYSE150，接种到6孔板中，调整细胞浓度为1 × 106个/ml，每孔中加入2 ml细胞悬浮液，培养过夜。将Lipofectamine 2000加入到EZH2 siRNA和siRNA对照中，室温下静置20 min形成转染复合物。取500 μl转染复合物加入到细胞中，放入培养箱中培养。（3）MTT检测细胞增殖：取转染后的食管癌细胞，调整细胞浓度为1 × 104个/ml，接种到96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl细胞悬液，培养箱中培养48 h，每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，弃上清后加入150 μl的DMSO溶液，震荡反应10 min后，在490 nm波长处检测每孔的吸光度（A）值，计算细胞存活率。设置EZH2 siRNA组、siRNA对照组及空白对照组，每组设5个复孔，实验重复3次。细胞存活率=（EZH2 siRNA组A值-空白对照组A值）÷（siRNA对照组A值-空白对照组A值）。（4）流式细胞术检测细胞凋亡：取转染后48 h的食管癌细胞，调整细胞浓度为1 × 106个/ml，取1 ml细胞悬浮液，加Annexin-V缓冲液，充分混合，加入5 μl的碘化丙啶和Annexin-V-FITC，避光条件下孵育20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。（5）Western blot检测EZH2、Caspase-3、STAT3、p-STAT3表达及H3K27甲基化水平：取处于对数生长期的人食管癌细胞KYSE150和人正常的食管上皮细胞HEEC，加入Trizol细胞裂解液3 ml，冰上裂解后，转移至离心管中，离心后蛋白上清转移到EP管中。按照BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书检测提取的蛋白浓度。将蛋白与上样缓冲液混合后，100℃煮沸变性5 min，加入到SDS-PAGE电泳凝胶中，每孔50 μl。电泳结束后取出蛋白凝胶，4℃下转印蛋白至PVDF膜上，依次加入一抗（800倍稀释）和二抗（1000倍稀释）后，滴加显色液，以GAPDH为内参，分析蛋白水平。
Western blot结果显示，人食管癌细胞KYSE150中EZH2表达水平高于正常食管上皮细胞HEEC（P < 0.01），见图1。转染EZH2 siRNA后，食管癌KYSE150细胞中EZH2蛋白水平降低（P < 0.01），见图2。
转染EZH2 siRNA 48 h后，食管癌KYSE150细胞存活率降低（P < 0.01），细胞凋亡率增高（P < 0.01）。见图3和图4。
转染EZH2 siRNA 48 h后，食管癌KYSE150细胞中Caspase-3表达增高（P < 0.01），p-STAT3表达下降（P < 0.01），STAT3表达则无明显改变（P > 0.05），见图5。甲基化检测结果显示，转染EZH2 siRNA后Act-H3（乙酰化）水平增高（P < 0.01），H3K27 me2（二甲基化）和H3K27 me3（三甲基化）表达下降（P < 0.01），见图6。
EZH2定位于EZH2 7q上，包含有20个外显子和19个内含子，其中外显子长度为41~323 bp，内含子长度为0.15~17.7 bp[5]。EZH2含有一个SET区域，该区域具有甲基转移酶活性的作用。另外，EZH2含有一个假结体，能够与SET共同作用于保守肽，使两个保守肽相互连接[6]。这种结构区域能够为甲基供体辅助因子和赖氨酸底物提供相应的结合位点。EZH2能够调控抑肿瘤基因的转录，在细胞信号通路转导过程中发挥调节作用；并可以聚集DNA甲基转移酶，导致DNA发生异常的甲基化[7,8]。
本研究检测了EZH2对食管癌细胞增殖和凋亡的影响，通过小RNA干扰技术，细胞转染EZH2 siRNA，Western blot检测证实，EZH2 siRNA成功干扰了EZH2蛋白的表达。MTT检测结果发现，沉默EZH2后食管癌细胞增殖能力明显降低。流式细胞术检测结果发现，沉默EZH2后食管癌细胞凋亡增多。提示，EZH2是一种癌基因，抑制EZH2的表达可抵制细胞增殖，促进细胞凋亡增多。
Caspase蛋白家族是目前研究最多的与凋亡相关的蛋白家族，其中Caspase-3是级联反应中凋亡的执行蛋白，Caspase-3活化后细胞凋亡进入不可逆阶段[9]。STAT3信号通路是细胞内重要的信号转导通路，与细胞的生长、增殖具有密切关系[10]。STAT3信号通路在肿瘤组织中异常活化，临床上常通过抑制STAT3信号通路治疗恶性肿瘤[11]。本研究中结果发现，沉默EZH2能够促进Caspase-3蛋白的活化，抑制STAT3蛋白磷酸化。提示，EZH2调控食管癌细胞增殖凋亡作用机制与STAT3信号通路有关。
组蛋白作为染色体组成的一部分具有两方面的作用，一方面可以发挥支持DNA的作用，另一方面可以调控基因的表达和基因组的印记[12]。组蛋白翻译后会进行多种修饰，例如甲基化、磷酸化、乙酰化等，正是因为组蛋白翻译后的多种形式的修饰，使其成为表观遗传学的重要组成部分[13]。组蛋白甲基转移酶催化位于H3和H4组蛋白N端的赖氨酸或者是精氨酸甲基化称之为组蛋白的甲基化，组蛋白的甲基化形式具有多样性，分为二甲基化、三甲基化和单甲基化。研究显示，H3K27三甲基化在肺癌和食管癌中表达上调[14]。H3K27甲基化具有一定的抑制效果，能够拮抗该位点的乙酰化[15]。本研究中结果发现，沉默EZH2后的食管癌细胞中H3K27二甲基化和三甲基化水平降低，而H3乙酰化增多。说明，EZH2能够通过调控H3K27甲基化影响食管癌细胞的增殖和凋亡。
综上所述，沉默EZH2能够抑制食管癌细胞增殖，促进食管癌细胞凋亡，作用机制与STAT3信号通路和组蛋白H3K27甲基化有关。这为进一步研究EZH2在食管癌中的作用机制奠定了基础，为诊断和预防食管癌提供了新的方向。
探讨小RNA干扰果蝇ZESTE基因增强子同源物2（EZH2）基因的表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。
EZH2 siRNA转染人食管癌细胞KYSE150后，MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blot检测细胞中EZH2、Caspase-3、STAT3和p-STAT3等蛋白表达情况及Act-H3（乙酰化）、H3K27 me2（二甲基化）和H3K27 me3（三甲基化）等甲基化水平。
转染EZH2 siRNA后，食管癌细胞中EZH2蛋白表达水平下降（P < 0.01），细胞存活率降低（P < 0.01），细胞凋亡率增高（P < 0.01）。信号通路检测，沉默EZH2后食管癌细胞中Caspase-3表达上调（P < 0.01），p-STAT3表达下调（P < 0.01），STAT3表达则无明显变化（P > 0.01）。甲基化检测，沉默EZH2后食管癌细胞中Act-H3表达增高（P < 0.01），H3K27 me2和H3K27 me3表达降低（P < 0.01）。
RNA干扰沉默EZH2基因能够抑制食管癌细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制与抑制STAT3信号通路及H3K27组蛋白甲基化有关。